论文摘要
先天性肛门直肠畸形是胚胎期后肠末端发育异常的一类疾病的总称,病变涉及肛门、直肠、尿道及外生殖器,是小儿最常见的消化道畸形,虽经治疗却常有不同程度的后遗症,严重危及患儿生命和生活质量,因此,对其发病机制的研究具有重要的意义。发生肛门直肠畸形是一个复杂的病理过程,涉及许多基因的异常调控,但迄今为止致病基因尚未明确,研究仍处于探索阶段。近年来研究发现,Shh/BMP4信号在高等脊椎动物的胚胎发育中具有非常重要的作用,它参与多种组织结构的形成。在肠道发育中,它的作用更为广泛,在维持肠上皮的生长、肠壁层次的形成、肠管沿前后轴的区域性分化以及肠神经系统的建成等诸多方面起着重要的作用。这个信号通路中的成员一旦发生突变将导致不同畸形和疾病,如食道闭锁/食管气管瘘、肛门闭锁和青少年肠息肉病等的发生。转基因动物实验发现敲除Shh信号的鼠发生了从单纯的肛门狭窄到复杂的一穴肛等各种不同类型的肛门直肠畸形,说明肛门直肠的正常发育需要Shh信号,提示我们肛门直肠畸形发生可能与Shh/BMP4信号异常有关。本研究包括动物实验和人体标本实验两部分内容:①ETU诱导大鼠胚胎肛门直肠畸形的演变与Shh/BMP4表达的关系的研究:用ETU致畸Wistar大鼠胚胎,观察畸形发生过程中的病理形态学变化并检测Shh/BMP4信号通路中的三个关键基因Shh、Gli2和BMP4在泄殖腔及直肠的表达模式和水平,从而探讨Shh/BMP4信号与肛门直肠畸形发生的关系。②Shh/BMP4信号在人类先天性肛门直肠畸形中表达的研究:检测肛门直肠畸形患儿直肠末端Shh/BMP4信号的表达状况,探讨这些基因与人类先天性肛门直肠畸形的关系,为寻找人类先天性肛门直肠畸形的致病基因提供线索。材料与方法一、实验材料实验动物:Wistar大鼠由中国医科大学盛京医院动物实验中心提供。病例标本:收集在我院手术治疗的肛门直肠畸形病人40例,其中低位畸形25例,高位畸形15例,男27例,女13例,平均年龄1.5个月。收集非胃肠道疾病死亡如新生儿窒息、颅内出血等10例为对照组,其中男6例,女4例,平均年龄1.0个月。标本处理:无菌条件下取直肠末端后壁肠组织,置于-75℃冰箱中保存。试剂及实验仪器:①试剂:ETU购于Sigma公司,Shh、Gli2和BMP4多克隆抗体购于Santa Cruz公司,SP试剂盒购于迈新公司,TRJZOL试剂、RT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司,引物由Invitrogen英骏生物技术有限公司合成。②仪器:NiKon Eclipse E800光学显微镜,NIS-Elements F2.30图像采集软件,UV-3000型紫外分光光度计,PTC-200TM型PCR扩增仪,天能公司GIS-2020型凝胶成像分析系统。二、实验方法1、ETU诱导大鼠胚胎肛门直肠畸形的演变与Shh/BMP4表达的关系的研究。①动物模型的建立:实验动物随机分为ETU组和对照组。在妊娠第10天时给ETU组孕鼠经胃管注入1%ETU,用量为125 mg/kg;对照组给予等量的生理盐水。分别于妊娠第12.5、13.5、14、15和16天共5个时间点剖宫取仔。②Shh、Gli2和BMP4免疫组化染色:对照组和ETU组的各时间组各取3只孕鼠,胎仔置于4%多聚甲醛中固定过夜,常规酒精脱水、石蜡包埋,所得标本矢状位连续切片,切片厚度4μm,然后取正中矢状位切片行免疫组化染色。③RT-PCR实验:对照组和ETU组的各时间组各取2只孕鼠,检测胚胎泄殖腔部分Shh、Gli2和BMP4的表达水平。④Western蛋白印迹实验:胎龄16天时,对照组、ETU致畸形组和未致畸形组各为30只胎仔,取其直肠检测Shh、Gli2和BMP4的蛋白表达。2、Shh/BMP4信号在人类先天性肛门直肠畸形中表达的研究。直肠标本的石蜡切片免疫组化染色、RT-PCR和Western蛋白印迹方法检测Shh、Gli2和BMP4基因在40例肛门直肠畸形病人和10例无畸形儿直肠末端的表达状态。3、数据的统计学处理:数值以（?）±s表示,用SPSS 13.0 for windows软件进行统计学分析,组间比较用单因素方差分析或t检验,P＜0.05有统计学差异。结果1、ETU诱导大鼠胚胎肛门直肠畸形的演变与Shh/BMP4表达的关系的研究免疫组化染色:组织切片观察ETU组63.2%胚胎发生肛门直肠畸形,对照组未见明显畸形,证实本组畸形稳定。鼠胚泄殖腔正常发育的形态学特点:胚胎12.5天到14天主要以泄殖腔形态变化为特征,同时可见生殖结节的迅速生长。胚胎14天到16天主要以尿直肠隔下降并与泄殖腔膜融合为主要特征。ETU组畸形鼠胚的泄殖腔发育主要有两个异常:一是在发育早期泄殖腔形态的异常,导致尿直肠隔的位置很高不能有效分隔泄殖腔;二是尿直肠隔下降障碍,未与泄殖腔膜融合,直肠和泌尿生殖道间存在共同通道而不能完全分离。Shh/BMP4信号在泄殖腔的表达模式:Shh和Gli2表达在泄殖腔、膀胱、尿道、直肠和肛门的上皮细胞,胞浆内呈浅棕色颗粒。BMP4的表达位于尿直肠隔内和泄殖腔、直肠、膀胱和尿道周围的间质细胞和胞外间质中,为胞浆及胞外间质染色,也呈浅棕色颗粒。在对照组胚胎14天,BMP4在尿直肠隔内及直肠周围表达最强。ETU致畸组Shh、Gli2和BMP4的表达较对照组明显减弱甚至缺乏。RT-PCR实验:Shh、Gli2和BMP4 mRNA扩增产物经电泳后,分别于预期的187bp、158bp和493bp处见条带,提示有Shh、Gli2和BMP4的mRNA表达。β-actin在各反应体系中扩增结果一致,证实PCR反应基本真实地反映了各基因的表达。在对照组的胚胎12.5-14天,Shh/BMP4mRNA的表达水平较高,在胚胎15-16天时略有下降;在ETU组,Shh/BMP4mRNA的表达水平均低于对照组,其中Shh和Gli2在胚胎12.5-14天、BMP4在胚胎14-16天的差异有统计学意义（P＜0.05）。Western蛋白印迹:对照组和ETU两组均出现被Shh、Gli2和BMP4抗体识别的显色带,其中对照组和ETU未致畸形组表达强度相似,对照组Shh、Gli2和BMP4蛋白的相对含量（1.127±0.13、1.527±0.16和0.980±0.05）与ETU未致畸形组（1.070±0.19、1.490±0.05和0.926±0.15）比较无统计学差异（P均大于0.05）。但ETU致畸形组Shh、Gli2和BMP4的条带明显减弱甚至消失,其蛋白的相对含量（0.886±0.09、1.060±0.08和0.913±0.04）与对照组和ETU未致畸形组比较有统计学意义（P值均小于0.05）。2、Shh/BMP4信号在人类先天性肛门直肠畸形中表达的研究免疫组化染色:Shh、Gli2表达在肠壁粘膜细胞的胞浆中,为棕黄色颗粒;BMP4表达在粘膜下层的间质细胞中,为胞核、胞浆着色,呈棕黄色颗粒。对照组和低位畸形组Shh、Gli2和BMP4均有明显染色,而在高位畸形组各基因的染色明显减弱。RT-PCR检测:扩增产物经电泳后,显示条带亮度各不相同。在高位畸形组,Shh、Gli2和BMP4 mRNA扩增条带多呈弱带或无带,在低位畸形组及对照组多呈亮带。半定量分析Shh、Gli2和BMP4 mRNA含量:高位畸形组的各值（0.63±0.27,0.23±0.08和0.69±0.25）比较低位畸形组（0.89±0.39,0.81±0.32和0.98±0.33）和对照组（0.91±0.71,1.24±0.38和1.11±0.45）明显下降（P＜0.05）;而在低位畸形组,除Gli2外,Shh和BMP4的表达与对照组无明显差异（P＞0.05）。Western蛋白印迹:各组与Shh、Gli2和BMP4抗体产生免疫反应在硝酸纤维膜上均呈现出条带,但各组、各基因表达的信号强弱不同。Shh、Gli2和BMP4蛋白的相对含量在高位畸形组分别为0.920±0.09、1.106±0.11和1.070±0.10,在低位畸形组分别为1.317±0.13、1.210±0.10和1.137±0.14,在对照组分别为1.586±0.08、1.430±0.09和1.520±0.08。统计学分析显示:高位畸形组比较低位畸形组和对照组各基因的蛋白表达量均有显著性下降（P＜0.05）,而低位畸形组与正常组比较,各基因的蛋白表达量无显著性差异（P＞0.05）。结论1、在大鼠胚胎发育过程中,Shh/BMP4信号表达在泄殖腔及直肠区域,调节泄殖腔及直肠的正常发育。2、ETU组鼠胚的泄殖腔和直肠的Shh/BMP4信号表达下降表明ETU扰乱了Shh/BMP4信号表达。3、在泄殖腔发育过程中,ETU组畸形鼠胚的泄殖腔区ShNBMP4信号表达水平下降,从而使泄殖腔不能正常发育,可能是导致肛门直肠畸形发生的重要因素之一。4、正常人的直肠末端存在Shh/BMP4信号表达,说明人类肛门直肠的生长发育需要Shh/BMP4信号的调节。5、高位肛门直肠畸形Shh/BMP4信号表达下调,提示人类高位肛门直肠畸形的发生可能与Shh/BMP4信号紊乱有关。6、与高位肛门直肠畸形不同,低位畸形Shh/BMP4信号表达水平与对照组一致,说明高、低位畸形可能涉及不同的机制,还有其他发育信号的异常参与低位畸形的发生。
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