利用反向Ras拯救恢复系统筛选拟南芥G蛋白互作因子

论文摘要

异三聚体G蛋白是在从酵母到人的所有真核生物中都高度保守的信号转导蛋白。它与偶联的膜受体蛋白和效应器蛋白合作,接受外界信息,并经过调整、集合与放大,准确无误地传递到细胞内,从而调控基本的生命过程,是细胞与环境信息交换必不可少的分子开关。异三聚体G蛋白属于GTPase,由α,β,γ三个亚基组成。研究表明,异三聚体G蛋白与含有七次跨膜结构域的质膜受体密切偶联（GPCRs）。目前哺乳动物中已发现大于20个Gα亚基,多于5个Gβ亚基,至少20个Gγ亚基。与哺乳动物相反,植物异三聚体G蛋白含有一个Gα亚基（GPA1）,一个Gβ亚基（AGB1）和两个Gγ亚基（AGG1和AGG2）。研究表明,植物G蛋白参与许多激素、发育及环境信号的应答,从而调控植物生长、器官发育及病害及逆境抗性等。对于拟南芥和水稻研究表明,异三聚体G蛋白能够直接地,间接地组织特异性地影响生长素、ABA、GA、油菜素内酯（brassinosteroid）、鞘脂（sphingolipid ）、D-葡萄糖信号、感受蓝光和病原菌信号传导等。虽然植物异三聚体G蛋白涉及广泛的信号转导过程,但已知的与Gα亚基或Gβγ二聚体相互作用的下游效应器还很少。但传统的方法,包括生物数据分析、遗传学与药理学等方法,对于筛选、鉴定植物G蛋白信号转导途径中的其它效应因子并不十分有效,因而寻找新的改良方法是必须的。在本项研究中,作者构建了拟南芥cDNA文库,借助酵母反向Ras恢复系统（reverse Ras Recruitment system,rRRS）来筛选、鉴定与拟南芥GPA1相互作用的蛋白因子,如ADL1C,ACC1,AtXB31等,并以AtXB31作为进一步的研究对象,通过Pull down,BiFC和CoIP等体外与体内蛋白结合实验证明了AtXB31同GPA1的互作。生物化学分析与异位过量表达,病原菌接种等遗传学研究进一步验证它们之间的相互作用。分离GPA1相互作用蛋白的突变体以及与包括gpa1在内的其它信号蛋白突变基因构成的双突变体。通过鉴定这些突变体对已知G蛋白介导的信号转导事件产生的效应与表型性状,揭示G蛋白信号转导途径的机理。取得的结果如下:1.提取拟南芥2星期和三星期幼苗,成熟的叶片、茎、花的总RNA,以随即引物为反转录引物,表达载体为pUra-Ras,构建了cDNA文库,1×105个克隆。2.构建pMet-WtGPA1,pMet-Q222L两种诱饵,借助反向Ras拯救恢复系统,筛选得到若干GPA1推论的互作因子,如:ADL1C,ACC1,AtXB31等。3.通过酵母双杂交,Pull down,BiFC,CoIP等体内体外蛋白互作实验,进一步证明AtXB31同GPA1的互作。其中酵母双杂交的互作发现,AtXB31的N-末端膜定位序列对于二者的互作是必需的。4.对于AtXB31结构分析表明,该基因具有三个保守domain,分别为:N-末端的膜定位序列,将蛋白定位在质膜上;锚定重复序列（ankyrin repeats）,参与蛋白互作;C3HC4的环形锌指结构,具有潜在的E3连接酶的活性。生物信息学预测该蛋白不具有跨膜结构。RT-PCR检测,该基因在植物的重要组织中均有表达,其中在花中表达较高。GFP亚细胞定位在质膜上。经ABA和病原菌处理之后,AtXB31表达量提高。5.AtGPA1同AtXB31有可能共同调控病原菌Xcc8004信号途径。通过对AtXB31的异位过表达和RNAi敲除转基因植株同野生型col-o形态学比较发现,基本没有差别。分别对GPA1的无义突变体gpa1-4和AtXB31过表达以及RNAi敲除植株接种病原菌,野生型作为对照。结果表明,gpa1-4和AtXB31RNAi敲除植株均出现了疑似感病症状。并且已经证明AtXB31在转录水平上响应该病原菌。因此推论AtGPA1和AtXB31很有可能参与Xcc8004病原菌的信号调控。黄单胞菌是可造成植物严重病害的细菌,如黑腐病。因此研究该病原菌同植物之间的信号传递途径,找出关键调控基因,对于防治该病原菌可提供重要理论依据。筛选、鉴定植物G蛋白相互作用因子,并剖析其生理功能和在G蛋白信号转导中的作用,从而揭示植物G蛋白信号转导过程中的分子运转机制,这不但具有深远的理论意义,而且具有现实的生产指导意义,为提作物高光合效率,改良作物品质,提高作物抗逆性等品种改良工作提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 异三聚体G 蛋白信号转导研究进展
• 1.1.1 哺乳动物异三聚体G 蛋白
• 1.1.2 异三聚体G 蛋白模式
• 1.1.3 植物异三聚体G 蛋白
• 1.1.4 植物G 蛋白的组成成分
• 1.1.5 植物G 蛋白响应众多信号途径
• 1.2 蛋白互作研究进展
• 1.2.1 Gal-4 酵母双杂交
• 1.2.2 酵母单杂交系统
• 1.2.3 酵母三杂交系统
• 1.2.4 酵母四杂交系统
• 1.2.5 逆向双杂交系统
• 1.2.6 泛素分离系统
• 1.2.7 RRS 和rRRS 酵母双杂交系统
• 1.3 拟南芥XBAT 家族基因研究进展
• 1.3.1 N-末端肉豆蔻酰基化
• 1.3.2 锚蛋白重复序列（ANK）
• 1.3.3 拟南芥E3 ligase
• 1.4 植物先天免疫研究进展
• 1.4.1 植物多层次的防卫反应
• 1.4.2 PAMP 激活的免疫反应
• 1.4.3 毒性病原菌抑制PAMP 激活的免疫反应
• 1.4.4 效应蛋白激活的免疫反应
• 1.4.5 植物先天免疫与动物先天免疫
• 1.4.6 黄单胞菌与植物互作的研究进展
• 1.6 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 实验引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥cDNA 文库的构建
• 2.2.2 Reverse RAS RecruitmentSystem 酵母双杂交
• 2.2.3 互作因子的鉴定
• 2.2.4 植物表达载体的构建与转化
• 2.2.5 拟南芥的培养，转化与筛选
• 2.2.6 病原菌的培养与接种
• 2.2.7 ABA 处理
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥cDNA 文库的构建
• 3.1.1 拟南芥总RNA 的提取
• 3.1.2 mRNA 的分离
• 3.1.3 cDNA 的合成
• 3.1.4 cDNA 与pUra 表达载体的连接与转化
• 3.2 Reverse RAS Recruitment System 酵母双杂交
• 3.2.1 Bait 的构建与转化
• 3.2.2 酵母双杂交的初步筛选
• 3.2.3 酵母双杂交的二次筛选
• 3.2.4 酵母双杂交阳性克隆的鉴定
• 3.3 AtXB31 基因的克隆及功能鉴定
• 3.3.1 AtGPA1 推论互作因子AtXB31 的获得
• 3.3.2 AtXB31 基因的克隆
• 3.3.3 AtXB31 蛋白的二级结构及功能性预测分析
• 3.3.4 XB 家族基因之间的比较分析
• 3.3.5 AtXB31 亚细胞定位
• 3.3.6 RT-PCR 检测AtXB31 的表达
• 3.3.7 正义以及RNAi 转基因植株的鉴定
• 3.3.8 Xcc8004 病原菌接种分析
• 3.4 AtXB31 同AtGPA1 体内体外蛋白互作的验证
• 3.4.1 酵母双杂交
• 3.4.2 Pull down
• 3.4.3 免疫荧光蛋白互作：BiFC
• 3.4.4 免疫共沉淀：CoIP
• 4 讨论
• 4.1 植物G 蛋白响应众多信号途径
• 4.2 反向Ras 拯救恢复系统适合研究植物蛋白互作
• 4.3 AtXB31 的结构与功能特征
• 4.4 AtXB31 同AtGPA1 体外与体内互作的验证
• 4.5 AtXB31 和AtGPA1 与病原菌Xcc8004 的信号转导
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况