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鹅血中超氧化物歧化酶的提取与性质研究

2020-12-13阅读(472)

鹅血中超氧化物歧化酶的提取与性质研究

论文摘要

我国是世界鹅生产第一大国,有丰富的鹅血资源。但除少部分用于加工鹅血豆腐、鹅血粉等产品外,大部分均被废弃。鹅血的营养价值很高,含有多种活性成分。本文以鹅血为原料,加入适量保护剂、溶膜剂,通过搅拌机剧烈搅拌得到溶血液,再以乙醇-氯仿、热变性处理得到鹅血超氧化物歧化酶（SOD）粗酶液,后经过丙酮初步纯化,DEAE-52纤维素进一步精制,冷冻干燥得到SOD纯品,并对鹅血SOD的部分性质进行了研究。研究内容和结果如下:第一,以鹅血为原料,分别研究了从抗凝鹅血和凝固鹅血中提取SOD的工艺。抗凝鹅血中提取SOD最佳工艺条件为:热处理时间15min,热处理温度60℃,激活剂CuCl2体积分数2.0%,SOD比活力为915.585U/mg;凝固鹅血提取SOD最佳工艺条件为:热处理时间15min,热处理温度60℃,激活剂CuCl2体积分数2.0%,SOD比活力为1144.896U/mg。可见,从凝固鹅血中提取的SOD比活力高（纯度高、活性好）,且提取过程不需加抗凝剂和分离血球,工序较简单。第二,利用丙酮初步纯化从凝固鹅血中提取的SOD粗酶液,考察了不同丙酮与粗酶液体积比值对SOD比活力的影响,得出丙酮与粗酶液体积比为1.0时,SOD比活力最高,为1547.42 U/mg。进一步考察了Sephadex G-100和DEAE-52纤维素纯化SOD的效果,确定了Sephadex G-100层析的进样量（2.5mL、5.0mL、7.5mL）和流速（1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min）。结果表明当进样量为5mL,流速为1.5mL/min,纯化效果最好,此时SOD比活力为9257.67 U/mg,纯化倍数为95.7;经DEAE-52纤维素层析后SOD比活力为9783.362 U/mg,纯化倍数为101.1,发现两种方法的纯化效果均较好,纯化倍数有很大提高,其中以DEAE-52纤维素纯化效果更好。第三,利用SDS-PAGE电泳和SOD活性染色进行纯度鉴定和亚基分子量测定,结果表明纯化的SOD已经达到电泳纯,亚基分子量为16KD。对鹅血SOD的部分理化性质进行了研究,包括最大紫外吸收峰测定、对KCN和H2O2的敏感性试验,SOD抗氧化活性,温度、pH值、金属离子等因素对SOD酶活的影响,结果表明:鹅血SOD最大紫外吸收峰为258nm,对KCN和H2O2均敏感（说明鹅血SOD类型为Cu/Zn-SOD）;鹅血SOD的抗氧化性较好,当加入SOD酶液达到50μL时,SOD对邻苯三酚自氧化速率的抑制率达50%;SOD的热稳定性较好,最适温度为60℃;在pH6.0～9.0范围内,SOD的酸碱稳定性较好,相对酶活力高,pH过高或者过低均易失活;不同金属离子对SOD活性有不同影响,对SOD活性激活作用的大小顺序为Cu2+>Zn2+>K+>Mg2+>Ca2+>Al3+,对SOD活性抑制作用大小顺序为Sn2+>Pb2+>Fe3+>Na+。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  • 1.1 超氧化物歧化酶的研究概况
  • 1.1.1 SOD 的种类与分布
  • 1.1.2 SOD 的结构
  • 1.1.3 SOD 的活性中心与催化机理
  • 1.1.4 SOD 的理化性质
  • 1.1.5 SOD 提取纯化工艺的研究
  • 1.1.6 SOD 的应用
  • 1.2 研究的目的和内容
  • 1.2.1 研究目的与意义
  • 1.2.2 研究的内容
  • 1.2.3 鹅血SOD 提纯试验流程图
  • 第2章 抗凝鹅血 SOD 提取工艺的研究
  • 2.1 材料、试剂与主要设备
  • 2.1.1 材料与试剂
  • 2.1.2 主要仪器
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 超氧化物歧化酶活力的测定
  • 2.2.2 蛋白质含量的测定
  • 2.2.3 抗凝鹅血中SOD 提取研究
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 抗凝鹅血的预处理
  • 2.3.2 去血红蛋白
  • 2.3.3 去杂蛋白工艺参数的优化
  • 2.4 结论
  • 第3章 凝固鹅血 SOD 提取工艺的研究
  • 3.1 材料、试剂与主要设备
  • 3.1.1 材料与试剂
  • 3.1.2 主要仪器
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 超氧化物歧化酶活力的测定
  • 3.2.2 蛋白质含量的测定
  • 3.2.3 凝固鹅血中SOD 提取工艺研究
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 凝固鹅血的预处理
  • 3.3.2 去血红蛋白
  • 3.3.3 去除其它杂蛋白工艺参数的优化
  • 3.3.4 从抗凝鹅血和凝固鹅血中提取SOD 效果的比较
  • 3.4 结论
  • 第4章 鹅血 SOD 纯化工艺的研究
  • 4.1 材料、试剂和仪器
  • 4.1.1 材料与试剂
  • 4.1.2 主要仪器与设备
  • 4.2 试验方法
  • 4.2.1 丙酮初步纯化
  • 4.2.2 Sephadex G-100 凝胶层析
  • 4.2.3 DEAE-52 纤维素层析
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 丙酮初步纯化
  • 4.3.2 Sephadex G-100 层析
  • 4.3.3 DEAE-52 纤维素层析
  • 4.3.4 两种层析效果比较
  • 4.3.5 鹅血SOD 最终提取纯化流程
  • 4.4 结论
  • 第5章 鹅血 SOD 的纯度鉴定及部分性质的研究
  • 5.1 材料、试剂和仪器
  • 5.1.1 材料与试剂
  • 5.1.2 主要仪器与设备
  • 5.2 试验方法
  • 5.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 5.2.2 SOD 活性染色
  • 5.2.3 鹅血SOD 性质的研究
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 SOD 纯度鉴定和分子量测定
  • 5.3.2 鹅血SOD 性质的研究
  • 5.4 结论
  • 第6章 结论、创新点和展望
  • 6.1 结论
  • 6.2 创新点
  • 6.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间的研究成果

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