论文题目: SPC-A1细胞应答呼吸道合胞病毒感染的敏感基因zlg10的克隆、表达及功能探讨
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 李蕾
导师: 张楚瑜
关键词: 细胞,呼吸道合胞病毒,差异显示法,融合蛋白,多克隆抗血清
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病毒性病原体。该病毒流行广泛,致病率高,多数儿童两岁前都感染过RSV,在老年人和免疫力低下的人群中也会暴发流行。RSV属副黏病毒科,肺炎病毒属,病毒粒子直径约150～300nm。RSV的基因组为单股负链RNA,长约15kb,编码11种蛋白质,包括3种核衣壳蛋白(核壳蛋白N、磷酸蛋白P、大聚合酶蛋白L);3种跨膜蛋白(融合蛋白F、附着蛋白G、小疏水蛋白SH);2种基质蛋白(M、M2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)。RSV感染的临床症状在不同年龄组往往不同,一般可致鼻炎、中耳炎、哮喘、支气管炎、细支气管炎和肺炎,尤其以后两种疾病最为严重,甚至可导致死亡。目前能有效治疗RSV感染的药物很少,且疗效不确定。世界卫生组织(WHO)已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。但迄今为止,尚无安全、有效的RSV疫苗获准上市。 分子生物学研究已经证实当病毒感染宿主细胞时,宿主细胞会发生变化,其中有一些特异性的序列表达量有所改变。mRNA差异显示法(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一。为了筛查到与病毒感染相关的宿主细胞敏感基因,本研究以呼吸道合胞病毒RSV感染的SPC-A1细胞与正常SPC-A1细胞为样本,通过mRNA差异显示技术获得了SPC-A1细胞应答RSV感染的mRNA差异表达谱,并且克隆到了50余个与呼吸道合胞病毒RSV致病相关的EST片段。随后选择在RSV感染后的SPC-A1细胞中高表达的EST片段g10-1为研究对象,经克隆测序g10-1长264bp,采用生物信息学方法对g10-1进行了鉴定后证实这是一个新基因片段,随后电子克隆获得的g10-1的延伸产物为761bp,含有一个编码54个氨基酸的读码框,命名为zlg10基因。zlg10编码的蛋白质与己知蛋白质均无显著同源性,亚细胞定位实验证实是一个新的核蛋白质。Northern Blot杂交分析验证后,设计了zlg10含完整阅读框的特异性扩增引物,通过RT—PCR方法克隆出了该基因。 为了了解新基因zlg10在RSV感染细胞过程中如何被调节以及在RSV感染过
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 呼吸道合胞病毒的生物学特性及其治疗和预防
1.1 前言
1.2 RSV的生物学和分子生物学
1.3 RSV的流行病学
1.4 RSV感染的免疫应答及发病机理
1.4.1 T、B淋巴细胞
1.4.2 CD_4~+和CD_8~+T淋巴细胞亚群及其细胞因子
1.4.3 嗜酸性粒细胞(EOS)及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白
1.4.4 趋化因子
1.4.5 黏附分子
1.4.6 IgE、IgG4抗体和其它
1.5 病毒感染治疗和预防
1.5.1 RSV感染的传统治疗方法
1.5.2 RSV感染的基因治疗
第二章 筛选差异表达基因的方法及应用
2.1 前言
2.2 筛选差异表达基因的方法
2.2.1 mRNA差异展示技术
2.2.2 消减杂交技术
2.2.3 RNA任意引物PCR
2.3 从EST出发快速鉴定新的差异表达基因
2.3.1 发现表达基因的新战略
2.3.2 利用EST电子杂交基因克隆
2.3.3 EST应用中应注意解决的问题
2.4 展望
第三章 SPC-A1细胞应答RSV感染的mRNA差异显示谱的研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 试剂
3.2.2 溶液配制
3.2.3 细胞培养与病毒感染
3.2.4 细胞总RNA提取
3.2.5 cDNA第一链合成
3.2.6 PCR反应
3.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染
3.2.8 二次PCR扩增和差异显示带回收
3.2.9 T-A克隆与测序
3.3 结果
3.3.1 细胞病变与RNA提取
3.3.2 PCR扩增条件优化
3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
3.3.4 克隆、测序和相似性检索
3.4 讨论
3.4.1 RNA的提取和反转录
3.4.2 差异显示方法改进
3.4.3 差异表达基因与功能分析
第四章 SPC-A1细胞应答RSV感染的敏感基因zlg10的克隆及其编码蛋白亚细胞定位的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 毒株和细胞
4.1.2 酶及试剂
4.1.3 溶液配制及处理
4.1.4 电子克隆的基本原理及步骤
4.1.5 含完整编码区的cDNA的克隆及验证
4.1.6 Northern Blot杂交分析
4.1.7 EGFP融合蛋白表达载体的构建及转染
4.2 结果
4.2.1 新基因片段g10-1的克隆及测序
4.2.2 新基因片段g10-1的鉴定
4.2.3 电子延伸结果、开放阅读框架及序列特征
4.2.4 蛋白质的特点及功能区的分析
4.2.5 zlg10的疏水性分析
4.2.6 zlg10跨膜区的分析
4.2.7 Northem Blot杂交分析
4.2.8 含完整编码区的cDNA的克隆及验证
4.2.9 细胞内EGFP融合蛋白的观察及定位
4.3 讨论
第五章 SPC-A1细胞应答RSV感染的敏感蛋白ZLG10的表达与纯化
5.1 材料与方法
5.1.1 毒株和细胞
5.1.2 质粒和菌株
5.1.3 工具酶、试剂和试剂盒
5.1.4 SDS-PAGE所用试剂与溶液
5.1.5 亲和层析及蛋白纯化相关试剂
5.1.6 引物设计与合成
5.1.7 重组表达载体pGEX-4T-zlg10的构建
5.1.8 GST-ZLG10融合蛋白的原核表达电泳样品制备
5.1.9 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
5.1.10 GSH亲和层析纯化GST-ZLG10融合蛋白
5.2 结果
5.2.1 zlg10基因的逆转录PCR扩增及鉴定
5.2.2 原核表达载体pGEX-4T-zlg10的构建及酶切鉴定
5.2.3 GST-ZLG10融合蛋白的表达和纯化
5.3 讨论
第六章 ZLG10特异性抗血清的制备及其功能研究
6.1 材料和方法
6.1.1 材料
6.1.2 溶液配制
6.1.3 兔抗GST-ZLG10融合蛋白多克隆抗血清的制备和纯化
6.1.4 ELISA法测定兔抗GST-ZLG10抗体的滴度
6.1.5 Western blot分析兔抗GST-ZLG10抗体的特异性
6.1.6 不同方式下ZLG10抗血清对病毒感染的抑制情况
6.2 结果
6.2.1 兔抗GST-ZLG10多克隆抗血清的制备和纯化
6.2.2 兔抗ZLG10多克隆抗血清抑制RSV感染的效果
6.3 讨论
研究总结
参考文献
在读期间发表的文章
致谢
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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