论文摘要
本试验通过在PK15细胞上增殖PCV2。浓缩纯化后,在紫外分光光度计上测得在280nm和260nm处的吸光度,根据公式计算得PCV2浓缩纯化后抗原的总蛋白浓度为:Pro（PCV2）=25.1970 mg/ml。在抗原中加入等体积的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂,分别制成完全佐剂抗原和不完全佐剂抗原,免疫8周龄Balb/c小鼠。三免过后,腹腔超强免疫一次,取小鼠的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,经自行建立的间接ELISA方法检测筛选,获得3株稳定分泌抗PCV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,依次命名为2B5、2D4、3C3。最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为25μg/ml,包被液为CBS（PH9.6、0.05M）,包被时间为37℃1h再4℃过夜,封闭物为1%的明胶,酶标二抗做1∶1000稀释。对筛选的阳性克隆进行特异性鉴定,结果表明:PCV2能有效地阻断杂交瘤细胞上清,竞争抑制率最高可达80%以上;用PRRS、PPV、PRV代替阻断试验中的PCV2,阻断前后的OD值没有明显的变化,说明没有交叉反应;用纯化的抗原包被,猪2型圆环病毒标准阳性血清检测试验结果显阳性;把PK15细胞按照抗原处理的方法做相同处理,然后包被板子或用细胞培养液包被,阳性杂交瘤细胞上清检测试验结果均显阴性。以上试验结果均说明,筛选的阳性克隆特异性良好。经检测,抗PCV2单抗的杂交瘤细胞上清及小鼠腹水单抗的ELISA效价最高可达1∶512和1∶102400。各株杂交瘤细胞的平均染色体数目在92-108之间,基本符合SP2/0细胞的染色体数目与正常小鼠脾细胞的染色体数目之和。经过连续传代25次和三次冻融复苏,杂交瘤细胞抗体分泌能力有轻微下降,但仍能稳定分泌抗体。利用腹水单抗建立了检测PCV2的双夹心间接ELISA方法。经鉴定,猪源抗PCV2高免血清抗体的效价是1∶3200,用时做1∶3200稀释;PCV2腹水单抗的效价是1∶102400,用时做1∶1600稀释,检测灵敏度为80.63ng/ml。此外还建立了检测猪PCV2血清抗体滴度的方法。这两种方法的建立,对于PCV2及其抗体的检测具有重要的应用价值,同时为进一步研制PCV2相关诊断试剂盒奠定了基础。