论文摘要
根结线虫在引起黄瓜侵染性病害的四大病原中,正逐渐成为仅次于真菌、细菌病害的一类重要的植物病原物。黄瓜根结线虫病已成为影响黄瓜生产较突出的问题.根结线虫的防治方法包括栽培防病、化学防病和抗线虫品种培育。抗线虫品种培育一直是育种家追寻的理想途径,但由于种质资源的匮乏,仅靠现有资源和常规育种方法很难育出抗线虫的黄瓜品种。利用生物技术辅助传统育种是解决抗源匮乏的有效途径。通过基因工程提高植物抗逆性技术早已在黄瓜育种中探索应用。RNA干扰（RNAi）是目前分子生物学研究的热点之一,是一种由同源序列引发的基因沉默现象。由于黄瓜组织培养困难,再生率较低,再生周期长,因而很少生物技术工作者选择黄瓜作为遗传转化的受体。因此,本试验着重开展了黄瓜高效植株再生体系的研究,黄瓜抗根结线虫RNAi载体的构建,农杆菌介导和花粉管导入技术转化黄瓜的研究,研究结果如下:（1）筛选出较为优化的黄瓜再生体系。取材时间以播种2天苗龄的子叶为最佳接种苗龄;取材部位以近叶柄端子叶为最佳再生外植体材料;最佳芽诱导培养基是MS+ 6-BA 1 mg·L-1 + ABA 1 mg·L-1+ Ades20 mg·L-1;培养早期Ades和ABA的存在能降低POD的含量,促进不定芽的再生。（2）构建了抗根结线虫的RNAi表达载体。提取带有根结线虫的黄瓜根系总RNA,利用RT-PCR扩增出根结线虫保守基因16D10,连接到T载体pMD-18上,测序表明所扩增的序列与已发表的四种主要根结线虫（南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫）序列具有很高的同源性,然后将16D10基因正向和反向插入到pBLUE载体上,构建了双链载体pBLUE-22-21,并将此双链基因插入到由35S启动子调控的克隆载体pRTL2上,命名为pRTL2-22-21,再将含有启动子和终止子以及双链的目的片段插入到双元表达载体pBIN-19上,得到表达载体pBIN-22-21。（3）研究了影响农杆菌介导的黄瓜遗传转化因素。不同基因型黄瓜品种对抗性芽数影响很大,鲁黄瓜8号适合作为转化材料;不同发育时期的子叶直接诱导黄瓜抗性芽的潜能不同,当两片子叶将要脱离种壳,子叶露出部分为绿色时进行外植体切割产生的抗性芽多;黄瓜对Kan较敏感,采用延迟筛选法进行筛选;同一浓度的Carb和Cef对黄瓜芽分化没有明显的差异,但综合抑菌效果,选择Cef 300 mg·L-1或者是Carb500 mg·L-1作为抑菌剂。（4）研究了花粉管通道法介导的黄瓜遗传转化。不同注射方法影响坐果率,采用授粉后24 h后用刀片沿柱头与子房颈分处切去柱头的方法较好。