本文主要研究内容
作者（2019）在《颠茄精氨酸酶基因的克隆与功能鉴定》一文中研究指出：托品烷生物碱（tropane alkaloids,TAs）是一类从茄科特定的植物中提取的含氮小分子有机物,主要包括为莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱等,其中,莨菪碱和东莨菪碱在在临床上作为抗胆碱药物广泛用于镇痛,麻醉、戒毒脱瘾和帕金森病的治疗。由于野生TAs药源植物中,托品烷生物碱含量极低,TAs的市场供求矛盾日益突出。因此,利用分子生物技术,通过引入TAs生物合成途径关键酶基因或调节蛋白基因来打破特定的限速步骤,从而显著增加靶向产物莨菪碱和东莨菪碱的含量,是目前TAs代谢工程领域的主要研究方法,而开展对TAs生物合成途径基因的功能鉴定是这一切的前提。颠茄是《中国药典》收录的重要的TAs商业药源植物.目前对以颠茄主要研究对象的TAs生物合成途径的解析取得了一定的进展,然而,有一些步骤依然,尚未明确。目前的研究表明,TAs的生物合成起始于鸟氨酸和精氨酸的脱羧反应。目前对腐胺生物合成的研究多集中于对ADC和ODC作用的评价,而对于精氨酸酶的在TAs生物合成的的研究鲜见报道,这严重限制了我们对TAs生物合成机制的理解和对相关基因的利用,因此本文以颠茄为材料对精氨酸酶基因展现了相关的研究。相关研究结果如下:本实验根据颠茄转录组数据库,筛选获得了一条精氨酸酶基因（AbARG）,其编码区全长为1014bp,该序列编码338个氨基酸多肽,分子量为37kDa,等电子点为5.78。氨基酸序列比对显示,AbARG在氨基酸水平上与植物精氨酸酶基因具有较高的相似度,如与烟草的一致性为96.2%,与番茄的一致性为88.5%,与葡萄的一致性为88.3%。AbARG与动物和微生物的精氨酸酸的氨基酸相似度极低,如与人的精氨酸酶的相似度仅为16.1%,而与枯草芽孢杆菌的相似度也仅为20%。而进化树分析也显示了植物的AbARG与烟草精氨酸酶亲缘关系最近。整体而言,植物界的精氨酸酶与微生物和动物的精氨酸酶在进化上亲缘关系较远。利用荧光定量PCR技术分析了AbARG的组织表达模式,研究结果表明,AbARG与已报道的TAs生物合成途径基因的组织表达模式有所不同,PMT、H6H表达具有根特异性,而AbARG在根、茎和叶等组织中均有类似水平的表达。在大肠杆菌中对AbARG进行了原核表达,利用镍柱纯化获得了纯度较高的重组蛋白,以精氨酸为底物对重组蛋白进行了活性鉴定。TLC实验结果表明AbARG能够催化精氨酸转化为鸟氨酸,即其具有精氨酸酶活性。酶动力学研究结果表明,AbARG Kcat为51.18 s-1,Km值为45.9±+3.25 mM,Vmax为1198.52±+83.75 nmol s-1mg-1。为了研究AbARG在TAs生物合成中的作用,本研究构建了AbARG过表达载体和干扰载体利用发根农杆菌C58C1介导转化颠茄外植体,在相关发根中均能在转基因发根中均能够检测到抗性基因NPTII和目的基因的存在,而在对照发根中检测不到NPTII的存在。荧光定量PCR检测结果表,AbARG在过表达发根中的表达量得到显著提高,而干扰发根中AbARG的表达量显著性降低,这表明我们获得了理想的转基因发根。过表达AbARG发根TAs含量检测表明,过表达AbARG对颠茄发根中莨菪碱、山莨菪碱及东莨菪碱含量无明显作用。而在干扰发根中,莨菪碱及山莨菪碱的含量都得到了显著性的降低,这表明AbARG的表达量的降低能够显著抑制TAs的生物合成。综上所述,AbARG展现出与植物界特别是烟草的精氨酸酶高度的氨基酸相似度和亲密的进化关系。与TAs生物合成途径基因组织表达模式不同的是,AbARG不具有组织表达特异性。酶动力学研究表明,AbARG能够高效的将精氨酸转化为鸟氨酸。AbARG的过表达对颠茄发根的TAs的生物合成无明显影响,但是AbARG表达量的降低显著抑制了颠茄发根中TAs生物合成。以上研究表明AbARG在TAs的生物合成中扮演着重要的角色,该研究对于解析TAs的生物合成机制具有重要的理论意义。
Abstract
tuo pin wan sheng wu jian （tropane alkaloids,TAs）shi yi lei cong jia ke te ding de zhi wu zhong di qu de han dan xiao fen zi you ji wu ,zhu yao bao gua wei lang dang jian 、shan lang dang jian 、dong lang dang jian deng ,ji zhong ,lang dang jian he dong lang dang jian zai zai lin chuang shang zuo wei kang dan jian yao wu an fan yong yu zhen tong ,ma zui 、jie du tuo yin he pa jin sen bing de zhi liao 。you yu ye sheng TAsyao yuan zhi wu zhong ,tuo pin wan sheng wu jian han liang ji di ,TAsde shi chang gong qiu mao dun ri yi tu chu 。yin ci ,li yong fen zi sheng wu ji shu ,tong guo yin ru TAssheng wu ge cheng tu jing guan jian mei ji yin huo diao jie dan bai ji yin lai da po te ding de xian su bu zhou ,cong er xian zhe zeng jia ba xiang chan wu lang dang jian he dong lang dang jian de han liang ,shi mu qian TAsdai xie gong cheng ling yu de zhu yao yan jiu fang fa ,er kai zhan dui TAssheng wu ge cheng tu jing ji yin de gong neng jian ding shi zhe yi qie de qian di 。dian jia shi 《zhong guo yao dian 》shou lu de chong yao de TAsshang ye yao yuan zhi wu .mu qian dui yi dian jia zhu yao yan jiu dui xiang de TAssheng wu ge cheng tu jing de jie xi qu de le yi ding de jin zhan ,ran er ,you yi xie bu zhou yi ran ,shang wei ming que 。mu qian de yan jiu biao ming ,TAsde sheng wu ge cheng qi shi yu diao an suan he jing an suan de tuo suo fan ying 。mu qian dui fu an sheng wu ge cheng de yan jiu duo ji zhong yu dui ADChe ODCzuo yong de ping jia ,er dui yu jing an suan mei de zai TAssheng wu ge cheng de de yan jiu xian jian bao dao ,zhe yan chong xian zhi le wo men dui TAssheng wu ge cheng ji zhi de li jie he dui xiang guan ji yin de li yong ,yin ci ben wen yi dian jia wei cai liao dui jing an suan mei ji yin zhan xian le xiang guan de yan jiu 。xiang guan yan jiu jie guo ru xia :ben shi yan gen ju dian jia zhuai lu zu shu ju ku ,shai shua huo de le yi tiao jing an suan mei ji yin （AbARG）,ji bian ma ou quan chang wei 1014bp,gai xu lie bian ma 338ge an ji suan duo tai ,fen zi liang wei 37kDa,deng dian zi dian wei 5.78。an ji suan xu lie bi dui xian shi ,AbARGzai an ji suan shui ping shang yu zhi wu jing an suan mei ji yin ju you jiao gao de xiang shi du ,ru yu yan cao de yi zhi xing wei 96.2%,yu fan jia de yi zhi xing wei 88.5%,yu pu tao de yi zhi xing wei 88.3%。AbARGyu dong wu he wei sheng wu de jing an suan suan de an ji suan xiang shi du ji di ,ru yu ren de jing an suan mei de xiang shi du jin wei 16.1%,er yu ku cao ya bao gan jun de xiang shi du ye jin wei 20%。er jin hua shu fen xi ye xian shi le zhi wu de AbARGyu yan cao jing an suan mei qin yuan guan ji zui jin 。zheng ti er yan ,zhi wu jie de jing an suan mei yu wei sheng wu he dong wu de jing an suan mei zai jin hua shang qin yuan guan ji jiao yuan 。li yong ying guang ding liang PCRji shu fen xi le AbARGde zu zhi biao da mo shi ,yan jiu jie guo biao ming ,AbARGyu yi bao dao de TAssheng wu ge cheng tu jing ji yin de zu zhi biao da mo shi you suo bu tong ,PMT、H6Hbiao da ju you gen te yi xing ,er AbARGzai gen 、jing he xie deng zu zhi zhong jun you lei shi shui ping de biao da 。zai da chang gan jun zhong dui AbARGjin hang le yuan he biao da ,li yong nie zhu chun hua huo de le chun du jiao gao de chong zu dan bai ,yi jing an suan wei de wu dui chong zu dan bai jin hang le huo xing jian ding 。TLCshi yan jie guo biao ming AbARGneng gou cui hua jing an suan zhuai hua wei diao an suan ,ji ji ju you jing an suan mei huo xing 。mei dong li xue yan jiu jie guo biao ming ,AbARG Kcatwei 51.18 s-1,Kmzhi wei 45.9±+3.25 mM,Vmaxwei 1198.52±+83.75 nmol s-1mg-1。wei le yan jiu AbARGzai TAssheng wu ge cheng zhong de zuo yong ,ben yan jiu gou jian le AbARGguo biao da zai ti he gan rao zai ti li yong fa gen nong gan jun C58C1jie dao zhuai hua dian jia wai zhi ti ,zai xiang guan fa gen zhong jun neng zai zhuai ji yin fa gen zhong jun neng gou jian ce dao kang xing ji yin NPTIIhe mu de ji yin de cun zai ,er zai dui zhao fa gen zhong jian ce bu dao NPTIIde cun zai 。ying guang ding liang PCRjian ce jie guo biao ,AbARGzai guo biao da fa gen zhong de biao da liang de dao xian zhe di gao ,er gan rao fa gen zhong AbARGde biao da liang xian zhe xing jiang di ,zhe biao ming wo men huo de le li xiang de zhuai ji yin fa gen 。guo biao da AbARGfa gen TAshan liang jian ce biao ming ,guo biao da AbARGdui dian jia fa gen zhong lang dang jian 、shan lang dang jian ji dong lang dang jian han liang mo ming xian zuo yong 。er zai gan rao fa gen zhong ,lang dang jian ji shan lang dang jian de han liang dou de dao le xian zhe xing de jiang di ,zhe biao ming AbARGde biao da liang de jiang di neng gou xian zhe yi zhi TAsde sheng wu ge cheng 。zeng shang suo shu ,AbARGzhan xian chu yu zhi wu jie te bie shi yan cao de jing an suan mei gao du de an ji suan xiang shi du he qin mi de jin hua guan ji 。yu TAssheng wu ge cheng tu jing ji yin zu zhi biao da mo shi bu tong de shi ,AbARGbu ju you zu zhi biao da te yi xing 。mei dong li xue yan jiu biao ming ,AbARGneng gou gao xiao de jiang jing an suan zhuai hua wei diao an suan 。AbARGde guo biao da dui dian jia fa gen de TAsde sheng wu ge cheng mo ming xian ying xiang ,dan shi AbARGbiao da liang de jiang di xian zhe yi zhi le dian jia fa gen zhong TAssheng wu ge cheng 。yi shang yan jiu biao ming AbARGzai TAsde sheng wu ge cheng zhong ban yan zhao chong yao de jiao se ,gai yan jiu dui yu jie xi TAsde sheng wu ge cheng ji zhi ju you chong yao de li lun yi yi 。
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