番茄ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆及Rhodobacter sphaeroidesTC40生产番茄红素的载体的构建

论文摘要

番茄红素属类胡萝卜素,是目前自然界中发现的最强的抗氧化剂之一。随着人类对番茄红素药用价值及医疗保健作用的不断发现,对其产量的需求也变的越来越大。目前番茄红素主要从植物中提取,不仅成本比较高,而且也难以进行规模化的生产,所以利用基因工程的方法定向培育出能够在菌体内大量积累番茄红素的微生物,而后利用发酵罐来大规模的生产番茄红素,有极大的应用价值,对满足人们健康的需求同样具有极大的现实意义。番茄红素在番茄果实中合成途径模式是:IPP→DMAPP→GPP→FPP→GGPP→Phytone→Lycopene。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应、共轭双键延长,经八氢番茄红素脱氢酶（PDS）脱氢形成ζ-类胡萝卜素,直至在ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS） ,类胡萝卜素异构酶（CRTISO）作用下一共进行四次脱氢反应形成番茄红素（Lycopene）。ZDS的cDNA全长1.8～2.lkb,编码558～574个氨基酸。ZDS和PDS基因大小相近,氨基酸同源性为29%～31%。番茄红素是番茄果实中类胡萝卜素代谢途径的中间产物,在自然界,类胡萝卜素合成途径广泛存在于动物,植物及微生物中,光合细菌（Rhodobacter sphaeroides）的类胡萝卜素代谢途径的中间产物与番茄果实中番茄红素合成途径具有相同的前体,IPP→DMAPP→GPP→FPP→GGPP→Phytone→Neurosporene。R. sphaeroides中八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）催化三次脱氢反应生成链孢霉素。因此,明确植物及微生物Crt途径基因的功能及作用机制,为通过基因工程生产研究番茄红素提供了重要前提。在植物基因工程中,已用噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）的CrtI基因替代植物中的PDS、ZDS和CRTISO这三个基因产生番茄红素。E.uredovora的CrtI基因与R. sphaeroides不同,催化四次脱氢生成番茄红素,而非R. sphaeroides的链孢霉素。已有研究表明E.uredovora的CrtI基因在R. sphaeroides中表达,可产生番茄红素。这些研究使我们对R. sphaeroides的Crt基因调控、操作机理更加明确,为利用基因工程技术改良R. sphaeroides的Crt途径生成番茄红素提供了理论依据。本文通过在R. sphaeroides定点突变株TC40中表达番茄ZDS基因生产番茄红素进行了以下研究。①分别提取普通番茄Breaker时期的果实,花,叶,茎中的总RNA。②比较了GenBank中已登录的多种植物的ZDS基因的氨基酸序列和核苷酸序列,在NEW ENGLAND查找酶切位点,发现ZDS基因序列上布满了酶切位点,表达载体PRKR5强启动子下游的酶在ZDS基因上都具有酶切位点,所以不能直接利用载体强启动子下游的酶点SacI和XbaI将ZDS基因引入表达载体。③试验设计了几个方案进行以便使目的基因ZDS能正确的接入载体进行表达。④在启动子和终止子处根据保守序列设计引物,利用RT-PCR和PCR技术从番茄果实,花,叶,中,克隆出番茄ZDS基因的cDNA序列。序列分析表明,ZDScDNA全长1776 bp,该cDNA编码一个含有589个氨基酸的膜结合蛋白,与NCBI登录的辣椒和拟南芥ZDS的cDNA序列的同源性分别为64.7%和64.5%,与辣椒和拟南芥的氨基酸序列同源性都为79.9%。⑤将质粒pMD18-T与PCR产物ZDS基因构建了中间载体pMD18-ZDS。⑥将质粒pMD18-T与PCR产物WYG基因构建了中间载体pMD18-WYG,用SacI, XbaI酶切pMD18-WYG,将WYG基因片段与用SacI, XbaI酶切的表达载体pRKR5连接构建中间载体pRKR5-WYG,在表达载体上引入XhoI酶切位点。⑦将中间载体pMD18-ZDS用XhoI酶切得到ZDS基因片段,将ZDS基因片段连入XhoI酶切后的质粒pRKR5,构建表达载体pRKR5-ZDS。⑧利用接合转移将载体pRKR5-ZDS重组至R. sphaeroides定点突变株TC40。⑨在TC40中表达ZDS基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 番茄红素的物理化学性质
• 1.2 番茄红素的生理作用
• 1.3 植物中的番茄红素合成基因及ZDS 基因的分子机制
• 1.3.1 植物中番茄红素合成基因
• 1.3.2 ZDS 基因的分子机制
• 1.4 光合细菌RHODOBACTER SPHAEROIDES 类胡萝卜素途径
• 1.4.1 光合细菌Rhodobacter sphaeroides 介绍
• 1.4.2 光合细菌Rhodobacter sphaeroides 类胡萝卜素合成基因
• 1.4.3 光合细菌Rhodobacter sphaeroides 突变株TC40
• 1.5 番茄红素的研究生产状况
• 1.6 本论文研究的目的与内容
• 1.6.1 研究的目的、意义
• 1.6.2 本文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒载体与菌株
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要分子生物学试剂和试剂盒
• 2.1.5 各种试剂及培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 番茄果实，花，叶，茎分别提取总RNA 提取
• 2.2.2 核酸质量及浓度测定
• 2.3 番茄ZDS 基因全长CDNA 的克隆及转化重组及鉴定
• 2.3.1 番茄ZDS 基因全长cDNA 片段的克隆
• 2.3.2 番茄ZDS 基因全长cDNA 片段的转化构建pMD18-ZDS
• 2.4 表达载体pRKR5-ZDS 的构建
• 2.4.1 表达载体pRKR5 多克隆位点的改建
• 2.4.2 表达载体 pRKR5-ZDS 的构建
• 2.5 Rhodobacter sphaeroides 的遗传转化
• 2.5.1 TC40 的转化重组
• 2.5.2 TC40 转化子的筛选
• 2.6 TC40 转化株的摇菌培养及番茄红素提取
• 2.6.1 TC40 转化株的摇菌培养
• 2.6.2 TC40 转化株番茄红素提取方法
• 2.6.3 番茄红素的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄果实，花，叶和茎各个组织的总RNA
• 3.2 番茄ZDS 基因的RT-PCR
• 3.3 番茄ZDS 与辣椒和拟南芥中的ZDS 比较
• 3.3.1 ZDS 与NCBIcDNA 的序列比较
• 3.3.2 ZDS 与NCBI 的蛋白质同源性分析
• 3.4 超表达载体PRKR5-ZDS 的构建
• 3.5 RHODOBACTER SPHAEROIDES 的遗传转化
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A: 期间发表的论文目录
• B: 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目