用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与Bax互作的抗凋亡基因

论文摘要

细胞凋亡是生物正常的生理现象之一,它与生物生长发育以及环境胁迫的反应具有密切的关系。细胞凋亡过程受到一系列促细胞凋亡基因和细胞凋亡抑制基因的调控。至今,已克隆了许多相关基因并研究其功能,如Bax基因的过量表达能诱导细胞凋亡的发生,Bcl-2家族的基因在凋亡过程中起举足轻重的作用。但细胞凋亡的分子机理仍不清楚。为了更深入地了解调控细胞凋亡的基因以及分子机理,本研究利用酵母双杂交技术在人胎脑cDNA文库中筛选具有抗Bax诱导的细胞凋亡功能的基因,并初步研究其抗凋亡的作用机理。1.成功构建了表达载体pJG45-PpBI-1和pGilda-Bax质粒,用于研究来自竹子的抗凋亡抑制基因PpBI-1的功能及其作为人胎脑cDNA文库中抗细胞凋亡基因筛选的对照。2.基于Bax基因的促凋亡功能的原理,利用酵母双杂交技术,获得了26个能在诱导培养基上正常生长的阳性菌株。通过对这些阳性菌株提取总DNA,用Bax基因引物BaxP1/BaxP2进行PCR验证。结果表明,在26个菌株中,有24个能扩增出Bax基因（占92.3%）,表明阳性菌株的抗性并不是由于Bax基因的丢失造成的,而是可能从人胎脑cDNA文库中筛选到了与Bax基因互作的抑制子。3.通过对筛选的阳性菌株的生长鉴定,表明各个菌株可能带有来自人胎脑cDNA文库的对Bax具有抑制功能的基因片段,从而表现出强弱不同的抗性。通过对其中11个筛选得到的文库cDNA片段进行PCR、测序、NCBI中BLAST分析,显示分别为人基因组的不同基因片段。4.为了验证cDNA文库基因片段的作用机理,通过连续多代培养和PCR验证的方法,获得丢失了文库cDNA基因片段但仍携带Bax基因的质粒菌株,然后对其进行敏感性试验,结果表明,选用的5个菌株在文库质粒丢失后,仍然表现出很强的抗性,对其可能的原因作了初步分析。5.将文库筛选得到的基因片段（B6、A10、A19）电转化大肠杆菌JM109,筛选转化子,进行生长试验。结果表明,含这3个cDNA文库基因片段的质粒转化后,均能在筛选培养基上长出转化菌株。初步分析了这些基因片段的作用机理。但对这些基因的编码蛋白及其抗细胞凋亡的机制还需进一步的验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.酵母双杂交系统
• 1.1 酵母双杂交系统的基本原理
• 1.2 酵母双杂交系统的应用
• 2.动物细胞程序性死亡/细胞凋亡
• 2.1 细胞凋亡特点
• 2.2 细胞凋亡途径
• 2.2.1 死亡受体途径
• 2.2.2 线粒体途径
• 2.2.3 内质网途径
• 2.3 凋亡调控基因
• 3.酵母细胞程序性死亡
• 4.抗凋亡基因的文库筛选
• 4.1 抗凋亡基因的文库筛选原理
• 4.2 抗凋亡基因的文库筛选方法
• 5.本研究的提出
• 第二章 材料和方法
• 1.材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 2.方法
• 2.1 分子克隆方法
• 2.1.1 质粒提取
• 2.1.2 DNA电泳
• 2.1.3 质粒DNA纯化
• 2.1.4 DNA酶切
• 2.1.5 载体脱磷
• 2.1.6 DNA片段回收
• 2.1.7 DNA连接
• 2.1.8 聚合酶链式反应（PCR）及其引物设计
• 2.1.9 感受态细胞制备
• 2.1.10 大肠杆菌转化（热击法）
• 2.1.11 大肠杆菌转化（电转化）
• 2.1.12 蛋白质电泳（SDS-PAGE）
• 2.1.13 Western blot
• 2.2 酵母实验方法
• 2.2.1 酵母转化
• 2.2.2 酵母细胞总DNA提取
• 2.2.3 酵母蛋白抽提
• 2.2.4 菌种保存
• 2.2.5 酵母点样
• 3 培养基和实验试剂
• 3.1 YPD（Yeast extract Peptone and Dextrose）
• 3.2 SD/gal/raf
• 3.3 SD/glu
• 3.4 质粒小提试剂
• 3.5 PBS缓冲液
• 3.6 蜗牛酶
• 3.7 磷酸钾缓冲液
• 3.8 Lyticase
• 3.9 蛋白质提取试剂
• 3.10 SDS-PAGE有关溶液
• 第三章 结果与分析
• 1.表达载体pJG45-PpBI-1和pGilda-Bax的构建
• 2.含Bax基因的载体导入酵母BF264—15Dau中
• 3.文库的扩增
• 4.文库的筛选
• 5.筛选获得菌株的生长鉴定
• 6.转化菌株Bax基因的PCR验证
• 7.cDNA片段的PCR验证
• 8.文库片段回收
• 9.测序
• 10.序列比对和分析
• 11.筛选到的菌株抗性验证
• 12.菌株抗性机理分析
• 12.1 文库质粒丢失筛选
• 12.2 文库丢失质粒菌株的PCR验证
• 12.3 文库质粒丢失后的抗性验证
• 12.4 基因转化验证
• 12.4.1 获得特定cDNA文库质粒
• 12.4.2 电转化大肠杆菌JM109
• 12.4.3 筛选出带有文库质粒的大肠杆菌JM109
• 12.4.4 含特定文库cDNA质粒转化酵母
• 12.4.5 点样实验
• 第四章 讨论
• 1、抗凋亡基因的筛选
• 2、文库筛选应注意的问题
• 2.1 质粒构建与选择
• 2.2 鉴定和验证
• 2.3 菌种保存
• 3、转化子筛选及其抗性的机制
• 4、需深入开展的工作
• 参考文献
• 致谢