贻贝蒸煮液水溶性多糖的分离纯化、结构分析和活性研究

论文摘要

贻贝蒸煮液由新鲜贻贝的煮汁经24小时加热浓缩而成，其中含有大量的可溶性蛋白质、糖类等营养物质和功能性成份。将贻贝蒸煮液中的水溶性多糖进行分离纯化，进而研究它们的理化性质、结构及活性，以期达到资源的有效利用、经济效益的提高和新功能性食品的开发等目的。首先，通过化学分析法对贻贝蒸煮液原料中基本成分进行分析。接着，采用乙醇沉淀、Sevage+木瓜蛋白酶法除蛋白、活性炭脱色从贻贝蒸煮液中分离出水溶性粗多糖MJPs，再经琼脂糖凝胶Sepharose4B柱层析和透析，纯化得到两种贻贝蒸煮液水溶性多糖MJPsⅠ和MJPsⅡ。经紫外扫描、醋酸纤维薄膜电泳、高效凝胶渗透色谱等方法检验它们的均一性。将得到的均一多糖MJPsⅠ和MJPsⅡ用苯酚-硫酸法测定总糖含量，高效凝胶渗透色谱法测定分子量，并利用气相色谱、红外光谱和核磁共振光谱，确定它们的初级结构。通过抑菌杯法、标准曲线法和DPPH·抑制率法分别测定贻贝蒸煮液和水溶性粗多糖MJPs的体外抑菌、体外NaNO2清除及NDMA合成阻断以及体外抗氧化活性，并对MJPsⅠ和MJPsⅡ的免疫学活性、抗肿瘤活性和抑制黑色素生成活性进行测定。实验结果表明，贻贝蒸煮液原料中糖类主要以非还原糖的形式存在，纯化得到的水溶性多糖MJPsⅠ和MJPsⅡ经检验为均一多糖。通过结构分析得到，MJPsⅠ主要由葡萄糖组成，平均分子量大于2．0×106Da，推测其结构为：MJPsⅡ主要由葡萄糖组成，平均分子量亦大于2．0×106Da，推测其结构为：{→2)-α-D-Glcp-(1→}n。在抑菌活性实验中，贻贝蒸煮液及MJPs对4种供试菌金黄色葡萄球菌、酵母菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌均无明显抑制作用；在体外NaNO2清除及NDMA合成阻断实验中，贻贝蒸煮液对NaNO2的清除作用和NDMA合成阻断作用极为显著，但是MJPs对NaNO2的清除和NDMA合成阻断活性不显著；在体外抗氧化实验中，贻贝蒸煮液（以可溶性固形物计）的IC50为3．80μg／mL，MJPs的IC50为1．12μg/mL，TBHQ的IC50为7．55μg/mL，MJPs的最大抑制率59．9％不如TBHQ的最大抑制率89．9％高，但是其IC50明显优于TBHQ。MJPsⅠ对小鼠T、B淋巴细胞有显著的正向调节作用，MJPsⅡ在低剂量下对小鼠B淋巴细胞有显著的负向调节作用，在高剂量下对小鼠T淋巴细胞表现出正向调节作用。此外，MJPsⅠ和MJPsⅡ均能显著抑制Raji细胞的增长和抑制黑色素的生成且对细胞毒性较小。贻贝蒸煮液粗多糖MJPs在低浓度下具有较强的抑制DPPH·的活性。分离纯化得到的贻贝蒸煮液均一多糖MJPsⅠ和MJPsⅡ具有免疫调节作用，抑制Raji细胞增殖和抑制黑色素生成的活性，并且它们的低毒性使其在保健品和美白化妆品的开发以及结合其他强抗癌制剂以降低药物的细胞毒性方面具有极大的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 研究背景和意义
• 1.2 贝类多糖的研究进展
• 1.2.1 分离纯化方法
• 1.2.2 结构分析方法
• 1.2.2.1 化学分析法
• 1.2.2.2 物理分析法
• 1.2.2.3 生物学方法
• 1.2.2.4 新技术的应用
• 1.3 贝类多糖的活性研究进展
• 1.3.1 免疫调节作用
• 1.3.2 抗肿瘤作用
• 1.3.3 抗病毒作用
• 1.3.4 其它作用
• 1.4 本研究的研究思路及研究内容
• 第2章 贻贝蒸煮液基本成分的研究
• 2.1 试剂与仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 常规成分的分析
• 2.2.2 氨基酸的组成测定
• 2.2.3 小分子肽含量的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 贻贝蒸煮液常规成分的分析
• 2.3.2 氨基酸组成的分析
• 2.3.3 小分子肽含量的测定
• 2.4 小结
• 第3章 贻贝蒸煮液水溶性多糖的分离纯化
• 3.1 试剂与仪器
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 贻贝蒸煮液水溶性多糖的制备
• 3.2.2 贻贝蒸煮液水溶性多糖的分离纯化
• 3.2.3 贻贝蒸煮液水溶性多糖的纯度鉴定
• 3.2.4 物理性质
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 贻贝蒸煮液水溶性多糖的制备
• 3.3.1.1 脱蛋白
• 3.3.1.2 脱色
• 3.3.2 贻贝蒸煮液水溶性多糖的分离纯化
• 3.3.2.1 透析
• 3.3.2.2 凝胶柱层析纯化
• 3.3.3 贻贝蒸煮液水溶性多糖的纯度鉴定
• 3.3.3.1 紫外扫描
• 3.3.3.2 醋酸纤维薄膜电泳
• 3.3.3.3 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）
• 3.3.4 物理性质
• 3.3.4.1 总糖含量分析
• 3.3.4.2 分子量测定
• 3.3.4.3 颜色反应
• 3.4 小结
• 第4章 贻贝蒸煮液水溶性多糖的结构研究
• 4.1 试剂与仪器
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 主要实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 单糖组成
• 4.2.2 红外光谱
• 4.2.3 核磁共振
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 单糖组成
• 4.3.2 红外光谱
• 4.3.3 核磁共振
• 4.4 小结
• 第5章 贻贝蒸煮液及其多糖体外抑菌、亚硝酸盐清除及抗氧化活性的研究
• 5.1 试剂与仪器
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 主要实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 体外抑菌活性
• 2清除及NDMA合成阻断'>5.2.2 体外NaNO₂清除及NDMA合成阻断
• 5.2.3 体外抗氧化活性
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 体外抑菌活性
• 5.3.2 贻贝蒸煮液及其多糖提取物体外阻断N-亚硝胺合成
• 5.3.2.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制
• 2的清除作用'>5.3.2.2 不同量的贻贝蒸煮液及其多糖提取物对NaNO₂的清除作用
• 5.3.2.3 不同量的贻贝蒸煮液及其多糖提取物对NDMA合成的阻断作用
• 2清除和NDMA合成阻断的对照及分析'>5.3.2.4 样液与Vc标准液对NaNO₂清除和NDMA合成阻断的对照及分析
• 5.3.3 贻贝蒸煮液及其多糖提取物的体外抗氧化活性
• 5.4 小结
• 第6章 贻贝蒸煮液水溶性多糖免疫学活性初步研究
• 6.1 试剂与仪器
• 6.1.1 材料与试剂
• 6.1.2 主要实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞的制备
• 6.2.2 T淋巴细胞增殖实验
• 6.2.3 B淋巴细胞增殖实验
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 小结
• 第7章 贻贝蒸煮液水溶性多糖抗肿瘤活性的研究
• 7.1 试剂与仪器
• 7.1.1 材料与试剂
• 7.1.2 主要实验仪器
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 细胞培养
• 7.2.2 抗肿瘤活性试验
• 7.2.3 细胞毒性试验
• 7.3 结果与讨论
• 7.4 小结
• 第8章 贻贝蒸煮液水溶性多糖抑制黑色素形成活性的研究
• 8.1 试剂与仪器
• 8.1.1 材料与试剂
• 8.1.2 主要实验仪器
• 8.2 实验方法
• 8.2.1 细胞培养
• 8.2.2 细胞生长和黑色素含量测定
• 8.3 结果与讨论
• 8.4 小结
• 第9章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢