蟾蜍毒素联合丁酸钠抗肿瘤作用及机制研究

论文摘要

肿瘤是一种由多因素、多步骤、多基因改变的疾病,每种药物均只能针对一种或几种靶分子起作用,如果将多种抑制剂联合应用可能会使药物发挥更好的效果,联合用药将成为医学肿瘤学的发展趋势。在美国举行的ASCO会议提出了靶向治疗、联合用药和应用多靶向药物的概念,这会比前几代药物更有效,产生更好的效果。有关肿瘤的发生发展机制到目前为止已经有很多说法,最近对于基因表型修饰以及信号传导等的研究成为热点。蟾蜍毒素是一种有效的细胞分化诱导剂。丁酸钠SB（Sodium butyrate）是去乙酰化酶抑制剂HDACI（Histonedeacetylase inhibitor）,通过对两种药物作用机理分析后,推断联合应用这两种药物可能通过以下途径起协同作用:①加强肿瘤细胞的周期抑制,使细胞阻滞在G1期;②抑制肿瘤周围血管生成及肿瘤细胞的转移;③调节与肿瘤增殖、周期相关蛋白如P21WAF1、P53和CDK4/CyclinD1蛋白的表达,④协同抑制细胞内的信号传导。再加上我们对肿瘤细胞的筛选的前期工作,我们认为两种药物有其合用的必要性和理论依据。本研究应用以下实验方法:1、胎盘蓝拒染法检测细胞数量和MTT法检测细胞活性,从而检测蟾蜍毒素联合丁酸钠药物合用后的效应,筛选出两种药物联合应用的最佳浓度和作用时间。2、应用WESTERN-BLOT检测蛋白变化、半定量RT-PCR检测基因变化。3、流式细胞术PI单染色法检测细胞周期,流式细胞术Annexin-PI双染色法检测细胞凋亡,从而研究蟾蜍毒素联合丁酸钠药物合用后的信号传导机制。结果显示:1、蟾蜍毒素和丁酸钠联合应用可以提高SMMC-7721细胞和A549细胞两种肿瘤细胞的凋亡率,与单独应用药物相比,差异具有显著性（P＜0.05）,但整体上我们所应用的药物浓度对细胞诱导凋亡的程度并不显著,联合应用两种药物仅仅将SMMC-7721细胞单独用药的凋亡率从9.85%提高到14.57%,虽然他们之间具有显著性差异,但是联合用药的诱导凋亡率不甚明显,这也说明在我们应用的药物浓度下两种药物更多的是联合抑制细胞的增殖而不是诱导细胞的凋亡。2、蟾蜍毒素和丁酸钠联合应用后,在肿瘤的周期影响方面,单独应用任意一种药物都可以将SMMC-7721细胞和A549细胞两种肿瘤细胞阻滞在G1期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。而联合应用两种药物后可以将SMMC-7721细胞G1期阻滞为77.13%,将A549细胞G1期阻滞为78.32%,两种肿瘤细胞G1期的阻滞更加明显,与单独用药相比差异具有显著性（P＜0.05）。3、对基因和蛋白的影响发现,单独用药也可以明显的增强P53和周期负性调控蛋白P21的表达,抑制周期正性调控复合物CDK4/CyclinD1的表达。以SMMC-7721的P21基因为例,单独应用SB时P21表达值为0.5,而联合用药物后为0.65,与单独用药差异具有显著性（P＜0.05）。应用P79350兴奋P38MAPK激酶活性后,P53、P21基因和蛋白表达减弱,而CDK4/CyclinD1基因和蛋白表达增强。这说明了协同应用蟾蜍毒素和丁酸钠两种药物后通过P38MAPK增强了P53、P21的表达,降低了CDK4/CyclinD1复合物的表达。这也证明了P38MAPK的信号通路通过细胞周期而介导细胞的增殖,通过改变这些相应的基因和蛋白的变化来调整A549细胞和SMMC-7721两种细胞株的周期和凋亡的变化。本实验应用体外试验的方法从用药浓度、用药时间以及从蛋白表达的水平和信号传导途径等角度系统的论证了联合应用蟾蜍毒素和SB两种药物对几种细胞株的抑制作用,并阐明了其合用的信号传导方面的机制,为下一步临床上的应用奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 蟾蜍药用历史
• 1.2 蟾酥分类
• 1.3 蟾酥抗肿瘤作用机制
• 1.4 蟾酥临床应用
• 1.5 介入疗法的临床应用
• 1.6 毒副反应
• 1.7 组蛋白去乙酰化酶的分类
• 1.8 HDAC抑制剂（HDACI）
• 1.9 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 细胞株
• 2.2 材料
• 2.3 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.5 统计学分析
• 第三章 结果
• 3.1 蟾蜍毒素和丁酸钠浓度筛选
• 3.2 蟾蜍毒素联合丁酸钠药物合用的信号传导机制
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介