木薯遗传图谱9号、17号和18号连锁群物理定位的研究

论文摘要

木薯（Manihot esculenta Crantz）属于世界三大薯类作物之一,它既是重要的粮食作物,也是一种重要的能源植物。国内外研究者已经利用多种标记方法构建了部分木薯遗传图谱,但其遗传图谱均未达到饱和。在这些遗传图谱中,有些图谱的连锁群数目大于18个,而有些图谱的连锁群数目虽然是18个,但均未知其连锁群与核型图的对应关系。本研究利用荧光原位PCR技术体系整合木薯的分子遗传图谱,将筛选得到的连锁群上的部分标记定位到木薯的染色体上,不仅可以确定现有的木薯遗传图谱的准确性及完整性,还可以将已报道的一些遗传图谱整合到木薯核型图中,达到构建木薯分子细胞遗传图谱的目标,为木薯选育种、种质资源鉴定、基因工程、比较基因组学等提供分子细胞遗传学依据。本实验的研究结果如下：1.针对Wenquan Wang等（2010）发表的木薯分子连锁遗传图谱中的9号、17号和18号连锁群,选择位于各连锁群两端的标记,合成了6对引物,包括9号连锁群上的SSRY28-L9和NS198-L9,17号连锁群上的SSRY36-L17和EST68-L17,以及18号连锁群上的SSRY161-L18和EST524-L18。其中SSRY28-L9引物能在木薯种质特异扩增出一个大小为190bp的片段；NS198-L9引物能在木薯种质扩增出4个片段,大小约为190-490bp；SSRY36-L17引物能在木薯种质特异扩增出一个大小为134bp的片段；EST68-L17引物能在木薯种质上扩增出4个片段,大小在800-1500bp之间；SSRY161-L18引物能在木薯种质特异扩增出一个大小为220bp的片段；EST524-L18引物能在木薯种质上扩增出2个片段,大小在250-270bp之间。2.在冯耀文（2011）已建立的木薯原位PCR技术体系的基础上,对一些处理过程进行了优化。最终优化后的体系是：原位PCR反应液总体积为50μl,其中各反应组分的浓度及用量为：5×Buffer10μl、MgCl2（25mM）9μl、dATP（10mM）1μl、dGTP（10mM）1μl、 dCTP（10mM）1μl、dTTP（3.6mM）1μl、DIG-11-dUTP（20μM）10μl、Taq DNA polymerase（5U/μl）1μl、F-Primer（20μM）5μl、R-Primer（20μM）5μl、ddH2O6μl。原位PCR扩增程序为：95℃预变性10min,94℃变性1min,50-56℃退火1min（视引物的Tm值）,72℃延伸2min,共25个循环,最后72℃延伸10min。前处理的操作流程为：0.01MHCl10min→5μg/ml胃蛋白酶（0.01M HCl稀释）消化10min→90℃灭活2min→0.5×TBS处理10min→灭菌水洗2×5min→70%甲酰胺70℃变性5min→预冷的0.1×SSC中冰浴1min→预冷的灭菌水中冰浴1min→依次75%、90%、100%的乙醇脱水各3min→原位PCR扩增。扩增后处理流程为：0.1×PBS37℃洗脱37℃孵育20min→50μl Anti-DIG-Fluorescein （20μg/ml）37℃孵育1h→0.1×SSC/吐温20洗脱2×4min→50μl PI （1μg/μl）37℃孵育15min→0.1×SSC/吐温20洗脱2×lmin→抗褪色剂DABOC封片→荧光检测。3.利用荧光原位PCR技术,对木薯9号连锁群上的SSRY28和NS198标记在木薯华南6号染色体上进行了物理定位的研究。研究表明,SSRY28标记能在华南6号不同时期的细胞上检测到2个信号,而NS198标记能在不同时期的细胞上检测到1个信号。结合核型分析,将SSRY28标记定位在华南6号的第3号染色体的短臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是31.67；将NS198标记定位在第3号染色体的长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是48.44。SSRY28和NS198两个标记位于同一对染色体上,并且分别位于该染色体的两端,进一步揭示了9号连锁群对应的是木薯的3号染色体。4.利用荧光原位PCR技术,对木薯17号连锁群上的SSRY36标记在华南6号染色体上进行了物理定位的研究。研究表明,SSRY36标记能在华南6号不同时期的细胞上检测到1个信号。结合核型分析,将SSRY36标记定位在华南6号的第2号染色体的短臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是60.17。结果初步揭示了17号连锁群对应的是木薯的2号染色体。5.利用荧光原位PCR技术,对木薯18号连锁群上的SSRY161和EST524标记在华南6号染色体上进行了物理定位的研究。研究表明,SSRY161和EST524两个标记都能在华南6号不同时期的细胞上检测到1个信号。结合核型分析,将SSRY161标记定位在华南6号的第10号染色体的短臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是65.21,将EST524标记定位第10号染色体的长臂上,扩增位点到着丝粒的百分距离是45.90。SSRY161和EST524两个标记位于木薯的同一对染色体上,并且分别位于该染色体的两端,进一步揭示了18号连锁群对应的是木薯的10号染色体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 木薯种质资源概述
• 1.1.1 国际木薯种质资源概况
• 1.1.2 国内木薯种质资源概况
• 1.1.3 中国木薯种质资源的引进情况
• 1.2 木薯遗传图谱的研究进展
• 1.2.1 遗传图谱概述
• 1.2.2 分子标记的种类
• 1.2.3 木薯遗传图谱的构建
• 1.2.4 木薯遗传图谱的应用
• 1.3 物理图谱概述
• 1.3.1 物理图谱的定义
• 1.3.2 物理图谱的绘制方法
• 1.4 原位PCR技术在植物研究上的应用进展
• 1.4.1 原位PCR技术的基本原理
• 1.4.2 植物原位PCR技术的操作步骤
• 1.4.3 原位PCR技术在植物研究中的应用
• 1.4.4 原位PCR技术在木薯研究中的应用
• 1.5 本研究的目的意义及技术路线
• 1.5.1 研究的目的意义
• 1.5.2 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要的仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 染色体标本的制备
• 2.2.2 木薯DNA的提取
• 2.2.3 特异引物合成与筛选
• 2.2.4 原位PCR技术流程
• 2.2.5 染色体上信号位置的确定
• 3 结果与分析
• 3.1 木薯基因组DNA提取
• 3.2 特异引物的筛选
• 3.3 染色体制片技术的优化
• 3.3.1 预处理药剂及预处理时间的选择
• 3.3.2 酶解时间的选择
• 3.4 木薯染色体原位PCR体系的优化
• 3.4.1 标本预处理的优化
• 3.4.2 扩增后处理的优化
• 3.5 木薯9号、17号和18号连锁群的物理定位
• 3.5.1 木薯9号连锁群的物理定位
• 3.5.2 木薯17号连锁群的物理定位
• 3.5.3 木薯18号连锁群的物理定位
• 3.5.4 木薯9号、17号和18号连锁群与其相对应染色体的整合
• 4 讨论
• 4.1 关于木薯染色体标本制备的问题
• 4.2 关于木薯原位PCR技术体系优化的问题
• 4.3 关于原位PCR检测的信号问题
• 4.4 原位PCR中的假阳性问题
• 4.5 关于木薯连锁群与核型整合时存在的问题
• 5 结论
• 参考文献
• 附录：试剂的配置
• 缩写词
• 致谢