多顺反子核转染小鼠胎肝细胞重编程为胰岛样细胞的初步研究

论文摘要

[研究背景]随着国家经济的快速发展,国民生活方式的巨大改变,我国糖尿病患病率正呈快速上升趋势。据中华医学会糖尿病分会2008年公布的调查结果,我国成人糖尿病的患病率已超过11%,糖调节受损的患病率已接近15%。糖尿病俨然已经成为患者和社会的巨大负担。目前普遍认为胰岛B细胞衰竭或功能障碍所致的胰岛素缺乏是糖尿病发病机制的核心环节之一。主要表现为胰岛β细胞破坏,致其功能缺陷,数量减少乃至缺失。保持和补足B细胞数量,是预防和治疗糖尿病的一条重要途径。埃德蒙顿方案的成功使胰岛移植成为有望根治糖尿病的重要策略。然而供体细胞来源极度缺乏以及免疫排斥这两大难题严重制约了胰岛移植的广泛开展。因此,寻找来源充足且安全有效的可供移植的胰岛素分泌细胞,成为胰岛移植领域岖需解决的核心难题之一。胰岛再生成为当前糖尿病治疗,尤其是胰岛移植细胞替代疗法的研究重点和热点。尽管诱导干细胞或成体细胞转化或转分化为胰岛素分泌细胞是近年来糖尿病细胞疗法研究的重要方向,但原有的多种方案,流程复杂繁琐,操作困难,细胞转分化率较低,转分化细胞生物学功能低下,无法满足移植的要求。并且存在致肿瘤、病毒感染、容易引起免疫反应、炎症和系统毒性等风险。因此,研究β细胞再生机制并探索β细胞新的来源是一项具有开拓性和挑战性的课题。最近国外学者利用基因直接重编程技术将肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞,其胰岛素表达水平明显高于通过再生因子或蛋白诱导分化的新生胰岛素分泌细胞。该方案流程简洁,操作简单快速,可直接实现成体细胞之间的转分化,而且细胞来源丰富,转化效率以及可行性和安全性高。因此,有必要进一步探讨肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞的有效途径及机制,为寻找新的胰岛移植细胞来源及方法提供实验依据。在人体发育过程中,肝脏与胰腺有着相同的来源,即内胚层细胞。这为肝细胞向胰岛B细胞的转分化提供了理论基础。我们查阅了大量文献都表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子（如Pdx1、MafA及Ngn3）可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。多顺反子载体系统可提供一个简单易操作的克隆构建载体平台,可以同时实现多个基因的表达。从而在很大程度上减轻重复克隆构建的工作强度。采用非病毒载体核转染法对靶细胞毒副作用很低,不激活癌基因和产生免疫反应,操作简单快速、重复性好。已经有研究证实,多顺反子载体可以成功实现肝细胞共表达Pdx1及Ngn3,因此我们提出：肝细胞通过多顺反子载体共表达Ngn3+Pdx1+Mafa实现向胰岛素分泌细胞转分化的设想,以期解决胰岛移植细胞来源匮乏的难题。本研究选择了小鼠胎肝细胞做为研究对象,在利用pcDNA3.1（+）为骨架,构建了三顺反子pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ngn33’UTR+pdx13’UTR及双顺反子pcDNA3.1（+）-ngn3ORF+pdx13’UTR之后,以转染试剂Lipofectamine2000为媒介,实现了Pdx1、MafA及Ngn3在胎肝细胞内的异位表达,并可成功的检测到胰岛素分泌细胞的标志性基因和蛋白的表达。[目的]1.成功构建可以表达小鼠Ngn3,Pdx1,MafA三个基因的以pcDNA3.1（+）为骨架的非病毒质粒载体2.将上述载体转染入小鼠胎肝细胞内,在转录和翻译水平分别观察上述三个目的基因及胰岛素表达相关基因Ins2在细胞中的表达,为进一步研究肝脏细胞转分化为胰岛素分泌细胞奠定基础。[方法]1.构建以pcDNA3.1（+）为骨架的三顺反子非病毒质粒载体pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ngn33’ UTR+pdx13’ UTR及双顺反子pcDNA3.1（+）-ngn3ORF+pdx13’ UTR并进行测序2.共同转染胰十二指肠同源框蛋白（Pdx1）、神经源素3（Ngn3）及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A（MafA）至小鼠胎肝细胞3.通过荧光定量PCR（Real-Time quantitive PCR）及间接免疫荧光法对转染后的细胞进行基因水平和蛋白水平的检测。看是否有三个目的基因Ngn3, Pdx1, MafA的表达以及胰岛素分泌细胞特异性Ins2基因及INSULIN蛋白的表达。[结果]1.构建了以pcDNA3.1（+）为骨架的质粒载体三顺反子pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ngn33’ UTR+pdx13’ UTR及双顺反子pcDNA3.1（+）-ngn3ORF+pdx13’ UTR,测序结果显示所获基因序列与Genebank报道的三个基因的序列一致,证实该载体构建成功。2.经过Lipofectamine2000的转染并培养后,荧光定量PCR检测显示,三个目的基因Ngn3, Pdx1在第2天和第5的细胞中均有表达,且在三顺反子中的表达多于双顺反子转染细胞（P<0.01）,MafA基因也在三顺反子转染组有着较高的表达,同时还在双顺反子转染组（不含MafA基因）中测到了少量的MafA基因的表达,与此同时还进行了Ins2基因的检测,显示均有不同程度的表达,且三顺反子组表达大于双顺反子组（P<0.01）。3Lipofectamine2000转染3天后的细胞进行了间接免疫荧光的检测,结果显示三个基因均有不同程度的表达,主要表达于细胞质。第5天的转染细胞组也测到了INSULIN蛋白的表达。[结论]1.利用DcDNA3.1（+）为骨架,可成功构建携带Pdx-1,Ngn3,MafA的真核非病毒载体pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ngn33’UTR+pdx13’UTR及pcDNA3.1（+）-ngn3ORF+pdx13’UTR。2.真核过表达载体pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ngn33’UTR+pdx13’UTR及双顺反子pcDNA3.1（+）-ngn3ORF+pdx13’UTR,在小鼠胎肝细胞BNL CL.2中可以得到三个目的基因在基因和蛋白水平上的成功表达,并且可诱导出胰岛素相关基因Ins2和INSULIN蛋白的表达

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 小鼠真核质粒载体pcDNA3.1（+）-mafa ORF+ ngn33’UTR+pdx1 3'UTR及pcDNA3.1（+）-ngn3 ORF+pdx1 3’UTR的构建
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 真核非病毒质粒载体在小鼠胎肝细胞表达及向胰岛样细胞转分化的初步探讨
• 1. 材料与方法
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明