卵清蛋白免疫耐受因子免疫学活性的研究

论文摘要

免疫耐受作为机体免疫调节的重要组成部分之一,在免疫系统识别“己”和“非己”的过程中发挥着关键作用。其中,外周免疫耐受的形成和维持与临床上自身免疫性疫病、过敏反应以及抗移植物排斥等人类重大疾病的治疗密切相关。因此,阐明外周耐受产生和维持的分子机制不仅有利于进一步完善免疫学理论,对于临床上免疫耐受相关疾病的治疗也具有十分重要的指导意义。根据外周耐受能够通过人工转移其效应细胞（或分子）在个体间进行传递的特点,人们发现,CD4+CD25+等调节性T细胞是外周耐受产生的主要介导者。此外,还有一些报道指出,某些大分子物质也能够转移特异性外周耐受给个正常个体。然而,小分子的非细胞成分是否也能够携带并传递特异性免疫耐受信息,至今未见相关报道。本研究就这一问题进行了初步探讨。本研究首先通过多次尾静脉注射卵清蛋白（ovalbumin, OVA）建立了对OVA免疫耐受的BALB/c小鼠模型,并对其耐受效果进行了鉴定。在此基础上制备了3个不同分子量范围的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液,通过对其转移耐受的效果进行评估,确定了转移OVA耐受的主要效应分子所在的分子量范围,并将这一分子量范围的细胞裂解液称为（OVA immune tolerance factors,OVA ITFs）。为进一步探讨OVA ITFs转移耐受的免疫学活性,本研究以OVA耐受鼠脾淋巴细胞为阳性对照,研究了OVA ITFs对正常BALB/c受体小鼠外周CD4+CD25+ T细胞亚群比例、DTH反应、OVA特异性T淋巴细胞增殖以及抑制性细胞因子IL-10、TGF-β1分泌水平的影响。现将研究结果报道如下:1. BALB/c小鼠多次尾静脉注射OVA（5μg/只）后,特异性T淋巴细胞增殖刺激指数（Stimulation Index ,SI）增殖的SI值为0.721±0.03,显著低于对照组（1.676±0.07）;CD4+CD25+T细胞亚群在总CD4+T细胞的比例为15.37±0.22%,较对照组小鼠显著升高（11.23±0.41%）。结果表明,多次注射小剂量OVA可建立BALB/c小鼠对OVA的免疫耐受。2.分别制备分子量小于3ku、35ku和大于5ku三个分子量范围的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液。体外试验显示,向淋巴细胞培养系统中加入2倍稀释的各分子量范围细胞裂解液,对OVA特异性T细胞增殖的抑制率分别为40.4%、18.4%和7.9%;体内试验显示,转移各分子量范围的细胞裂解液给正常小鼠后,受体鼠OVA特异性T细胞增殖的SI值分别为0.557±0.02、0.954±0.07和1.094±0.01,与空白组（1.110±0.09）相比,只有分子量小于3ku的裂解液产生的具有显著的抑制效果。此外,各分子量范围的细胞裂解液还产生了一定的非特异性抑制作用。结果表明,分子量小于3ku的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液能够显著抑制OVA特异性T细胞的增殖。3.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后,受体鼠脾脏CD4+CD25+ T细胞亚群在总CD4+ T细胞的比例逐渐上升,分别于转移后7天和3天达到峰值,为15.32±1.03%和15.35±0.62%;外周血中CD4+CD25+ T细胞亚群的比例也分别于转移后7天和3天达到峰值,为10.10±0.21%和10.07±0.07%,均较转移前（9.97±1.38% and 7.28±0.12%）显著上升。结果表明,OVA ITFs能够诱导外周CD4+CD25+T细胞的产生,但与耐受鼠淋巴细胞相比,其诱导外周CD4+CD25+ T细胞亚群达到峰值需要更长的时间。4.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后免疫OVA并激发DTH,检测其对OVA特异性免疫反应的抑制效果。结果表明,OVA ITFs能够有效抑制受体小鼠的DTH反应,其反应部位的皮肤增厚下降了60%。5.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后免疫OVA,受体鼠特异性淋巴细胞增殖的SI值分别为0.699±0.05和0.704±0.03,与对照组（1.356±0.07）相比明显受到抑制;培养上清中TGF-β1的分泌量分别为129.15±6.14和106.71±2.89 pg/mL,显著高于对照组（52.82±3.68 pg/mL）, IL-10的分泌量未检出。结果表明,OVA ITFs能有效抑制OVA特异性T细胞的增殖并促进抑制性细胞因子TGF-β1的的产生。6.转移空白小鼠的脾淋巴细胞裂解液（OVA ITFs control）后,受体小鼠的外周CD4+CD25+ T细胞比例、OVA特异性淋巴细胞增殖及TGF-β1、IL-10分泌量均无显著变化。说明OVA ITFs并非机体的固有成分,而是由免疫耐受个体获得性产生的。以上研究结果表明,本研究所制备的OVA ITFs具有将OVA特异性免疫耐受传递给正常受体小鼠的特性。这一结果首次证明了小分子物质也能够携带并传递特异性免疫耐受信息,这对进一步阐明外周耐受的分子机制以及指导临床上自身免疫病、抗移植物排斥等免疫耐受相关疾病的治疗具有重要的参考价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 免疫耐受的研究进展
• 1.1 免疫耐受的发现
• 1.1.1 中枢免疫耐受的发现
• 1.1.2 外周免疫耐受的发现
• 1.2 外周免疫耐受与人类重大疾病、动物疫病的关系
• 1.2.1 外周免疫耐受与自身免疫病
• 1.2.2 外周免疫耐受与移植免疫
• 1.2.3 外周免疫耐受与病毒性疾病
• 1.2.4 外周免疫耐受与肿瘤病
• 1.3 外周耐受的人工诱导
• 1.3.1 抗原诱导的外周免疫耐受
• 1.3.2 耐受转移诱导的外周免疫耐受
• 1.3.3 T 细胞疫苗诱导外周免疫耐受
• 1.3.4 外周免疫耐受的鉴定
• 1.4 外周免疫耐受形成和维持机制
• 1.4.1 调节性T 细胞与外周免疫耐受
• 1.4.2 树突状细胞与外周免疫耐受
• 1.4.3 外周免疫耐受的其他机制
• 1.5 本研究的内容和目的意义
• 第二章 小鼠OVA 外周免疫耐受的诱导及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物及其分组
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 尾静脉注射OVA 诱导外周耐受
• 2.2.2 初次免疫及再次免疫
• 2.2.3 脾淋巴细胞悬液的制备
• 2.2.4 淋巴细胞增殖试验
• 2.2.5 流式分析
• 2.2.6 显著性检验
• 2.3 结果
• 2.3.1 脾脏淋巴细胞对OVA 特异性刺激的增殖反应
• +CD25⁺ T 细胞亚群比例的变化'>2.3.2 脾脏CD4⁺CD25⁺ T 细胞亚群比例的变化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 小鼠OVA 免疫耐受因子转移耐受活性的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 尾静脉注射OVA 诱导外周耐受
• 3.2.2 不同分子量范围耐受小鼠脾细胞裂解液的制备
• 3.2.3 OVA 免疫耐受小鼠脾淋巴细胞悬液的制备
• 3.2.4 OVA 免疫耐受因子（OVA ITFs）的制备
• 3.2.5 不同分子量范围的耐受小鼠脾细胞裂解液转移免疫耐受效果的检测
• 3.2.6 OVA ITFs 转移免疫耐受效果检测
• 3.2.7 淋巴细胞增殖试验
• 3.2.8 迟发型超敏反应（DTH）检测
• 3.2.9 流式分析
• 3.2.10 细胞因子测定
• 3.2.11 显著性检验
• 3.3 结果
• 3.3.1 不同分子量范围耐受小鼠脾细胞裂解液对特异性淋巴细胞增殖的影响
• 3.3.2 OVA ITFs 对受体鼠外周 CD4+CD25+ T 细胞亚群比例的影响
• 3.3.3 OVA ITFs 对受体鼠抗原特异性迟发型超敏反应（DTH）的影响
• 3.3.4 OVA ITFs 对受体鼠抗原特异性淋巴细胞增殖的影响
• 3.3.5 OVA ITFs 对受体鼠细胞培养上清中 TGF-β1 分泌水平的影响
• 3.3.6 OVA ITFs 对受体鼠细胞培养上清中 IL-10 分泌水平的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 不同分子量范围的耐受小鼠脾细胞裂解液转移免疫耐受的活性
• 3.4.2 OVA ITFs 转移免疫耐受的活性
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介