论文题目: 含硫肽类抗生素基因工程的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药物化学
作者: 文勇
导师: 周佩
关键词: 活跃链霉菌,那西肽,血红蛋白,原生质体质粒转化,接合转移,青霉素酰化酶,克莱博氏菌,酶学性质,发酵优化
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文研究内容包括两个部分,第一部分为克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因工程的研究;第二部分为那西肽产生菌活跃链霉菌(Streptomyces.actuosus)基因工程的研究。 第一部分 1932年,英国科学家弗来明发现了青霉素。它高效广谱的抗菌效果使之在临床上被广泛使用。然而伴随着青霉素日益广泛甚至过度的使用,导致了抗性病原体的产生。利用新型半合成抗生素是克服这种抗性病原体产生的唯一方法。半合成抗生素具有较少副作用、较小毒性、有较大的抗病原专一性、较宽抗菌谱和较好的药理学活性而主导着世界抗生素市场。青霉素G酰化酶(penicillin G acylase,PGA,EC 3.5.1.11)能水解青霉素G产生6-氨基青霉烷酸(6-APA),6-APA是半合成青霉素的关键中间体;另外,作为生物催化剂,PGA在许多有潜在价值的反应中也发挥了重要作用,例如多肽合成中保护氨基和羟基;PGA还可应用于氨基酸、β-氨基酯、胺类等手性化合物的拆分。拆分得到的纯的对映异构体可用作合成有生物活性组分的中间体。现已在许多微生物体内发现有该酶存在,如各种细菌、放线菌、真菌和酵母等。虽然大肠杆菌的PGA是工业应用上最为重要的来源,但开发和应用其他来源的PGA也取得了令人鼓舞的成果。与大肠杆菌的PGA相比,来自克莱博氏菌的青霉素G酰化酶具有对温度、pH的耐受性,与有机溶剂的共溶性,而且易固定化等优点。然而,到目前为止,对来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶的研究还主要集中于分子特性以及底物特异性的研究,系统地利用基因工程技术、发酵工程技术来研究和开发此酶在工业生产上的应用还未见报道。因此,本研究首次以来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶为研究对象,利用DNA重组技术将编码克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因克隆入质粒pET28b,获得一个C端含6个组氨酸的融合蛋白表达载体pETKcPGA。在LB培养基中,
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一部分 克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因工程的研究
第一章克 莱博氏菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的表达
前言
1．材料与方法
1．1 材料
1．2 方法
2．结果与讨论
2．1 IPTG浓度对表达的影响
2．2 His-taggedKcPGA的纯化及动力学参数
2．3 纯化后的重组KcPGA的酶学性质
小结
参考文献
第二章 克莱博氏菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中表达条件的优化
前言
1．材料与方法
1．1 质粒与菌种
1．2 培养条件
1．3 样品处理
1．4 酶活测定
1．5 培养条件的优化
1．6 质粒稳定性
2．结果与讨论
2．1 培养基对KcPGA表达的影响
2．2 不同培养条件对KcPGA的影响
2．3 通气量对KcPGA表达的影响
2．4 碳源对KcPGA表达的影响
2．5 质粒稳定性
小结
参考文献
第二部分 那西肽产生菌Streptomyces.actuosus基因工程的研究
前言
第一章 质粒转化法构建的重组S.actuosus及其对那西肽产量的影响
1．材料与方法
1．1 材料
1．2 方法
2．结果与讨论
2．1 重组S.actuosus/pSEVhb的PCR鉴定
2．2 CO结合实验分析
2．3 总糖量的变化
2．4 限氧条件对VHb表达量的影响
2．5 限氧条件下VHb的表达对重组菌菌体生长的影响
2．6 VHb表达对那西肽发酵产量的影响
2．7 重组菌的稳定性
第二章 接合转移法构建的重组S.actuosus及其对那西肽产量的影响
1．材料与方法
1．1 材料
1．2 方法
2．结果与讨论
2．1 重组S.actuosus/pZP3的PCR鉴定
2．2 CO结合实验分析
2．3 总糖量的变化
2．4 限氧条件对VHb表达量的影响
2．5 限氧条件下VHb的表达对重组菌菌体生长的影响
2．6 VHb表达对那西肽发酵产量的影响
2．7 重组菌的稳定性
小结
参考文献
全文总结
综述
第一部分 青霉素G酰化酶的研究进展
第二部分 透明颤菌血红蛋白的研究进展
致谢
攻读博士期间已发表和待发表的文章
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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标签：活跃链霉菌论文; 那西肽论文; 血红蛋白论文; 原生质体质粒转化论文; 接合转移论文; 青霉素酰化酶论文; 克莱博氏菌论文; 酶学性质论文; 发酵优化论文;