论文摘要
人白细胞介素-23受体（human Interleukin-23 receptor,hIL-23R）)是2002年报道的细胞因子受体,和IL-12Rβ1共同组成IL-23受体复合物,IL-23R蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成,与IL-12Rβ2的胞外区域很相似,包含一个N端免疫球蛋白样结构域和两个细胞因子受体功能域。与IL-12Rβ2不同,IL-23R没有邻近膜的三个纤维蛋白原Ⅲ型功能域。在hIL-23R上有7个潜在的N-糖基化位点,其胞膜近侧区有类似于细胞因子受体特征性WSXWS模序的WQPWS,IL-23R复合物中的IL-12Rβ1能识别IL-23的IL-23p40亚单位并与之结合,由IL-23R介导细胞内的信号转导。由于IL-23及其受体与IL-12及其受体在结构上的相似性,所以人们对于IL-23及其受体的功能研究很多是基于对IL-12及其受体的研究进行的。国外已有研究证明IL-23在抗肿瘤方面有一定的作用,而且IL-12Rβ2基因在慢性B细胞恶性肿瘤中作为肿瘤抑制因子,但目前关于IL-23R和肿瘤的相关性尚未有报道。我们前期研究发现了在一些肿瘤细胞有IL-23R剪接异构体的表达,但目前对于hIL-23R的功能研究尚处于初始阶段,对于hIL-23R的功能研究很多正在进行中。本课题包括的研究内容有:1)首先从外周血单个核细胞（PBMC）中利用一对特异性引物克隆得到人白细胞介素23受体（hIL-23R）基因,分别构建真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R和原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R。2)真核表达hIL-23R蛋白,并研究其细胞定位及对细胞周期和细胞凋亡的影响。3)原核诱导GST-hIL-23R融合蛋白表达。4)用基因工程方法分别构建hIL-23R胞外区、胞内区的原核表达载体,诱导带有GST标签的hIL-23R蛋白分段表达,为进一步研究hIL-23R的功能做准备。第一阶段为克隆hIL-23R基因,从外周血单个核细胞中克隆得到1890bp的hIL-23R基因,连接于pMD-19-T载体,用测序正确的pMD-19-T-hIL-23R做模板以PCR方法扩增hIL-23R,分别构建真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R和原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R。在第二阶段的工作中,通过将pCMV-Myc-hIL-23R转染HEK 293T细胞,用RT-PCR和Western-blot方法检测到其成功表达,用免疫荧光染色对hIL-23R蛋白在HEK 293T细胞和COS-7细胞中进行细胞定位;并通过流式细胞术检测了hIL-23R蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响。在第三阶段的工作中,通过将pGEX-4T-1-hIL-23R转化大肠杆菌BL21（DE3）,成功地诱导了带有GST标签的hIL-23R重组蛋白。发现该蛋白以包涵体形式存在,并用Western-blot验证了GST融合蛋白的表达,为得到hIL-23R蛋白抗体做了准备;在第四阶段的工作中,在大肠杆菌中成功地诱导了带有GST标签的hIL-23R重组蛋白的胞内区和胞外区,改变诱导条件（低温诱导）后胞内区蛋白有可溶性表达,而胞外区蛋白仍为包涵体表达,为hIL-23R蛋白的纯化和制备针对hIL-23R胞内区的抗体做准备,利用其抗体可以研究hIL-23R与肿瘤的发生的相关性。结论:我们从外周血单个核细胞中克隆得到了hIL-23R的编码区,分别构建了原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R和真核表达载体pCMV-Myc-hIL-23R。并分别在大肠杆菌和HEK 293T细胞中表达了hIL-23R蛋白;通过将hIL-23R转染HEK 293T细胞,研究了hIL-23R蛋白表达对细胞周期和细胞凋亡的影响;通过对hIL-23R的分段表达,得到了可溶性表达的hIL-23R胞内区蛋白;成功搭建了为进一步研究全长hIL-23R功能的多种平台。本研究为hIL-23R的功能研究及其与肿瘤的相关性研究提供了依据,但其参与抗肿瘤的机制及能否应用于临床研究,还需要进一步探讨。