椰子SSR分子标记的开发

论文摘要

椰子（Cocos nucifera L）栽培历史悠久,在长期自然进化和人工栽培驯化过程中形成许多变种、品种和类型。长期以来,对椰子品种间的历史演化、亲缘关系等都未能深入的进行研究,从而影响优良种质的推广以及椰子产业的发展。因此,想要更深入的研究椰子品种间的遗传关系,构建椰子的遗传连锁图谱,培育优良的椰子品种,就必须找到一个强有力的进行椰子种质分析的工具。鉴于此,本研究采用近年来发展起来的分子标记技术开展了椰子SSR分子标记的研究工作。椰子SSR分子标记的开发和应用的研究较少,现有的椰子SSR标记的数量有限,不能满足进行椰子品种的快速鉴定、种质资源遗传关系的分析、分子遗传图谱的构建、重要性状QTLs的定位和分子标记辅助选择育种等。因此,本研究应用选择性扩增微卫星法（Selectively Amplified Microsatellite）进行椰子SSR分子标记的开发,并利用开发的SSR标记,对42份国内外椰子种质材料进行了遗传多样性分析和指纹图谱的构建,同时利用开发的SSR标记对棕榈科不同属植物进行通用性研究。主要结果如下:（1）成功地开发了84个椰子特异性SSR标记,从测序算起,产生多态性SSR标记的效率为22.1%。（2）设计的椰子特异性SSR标记不包含有5′锚定引物,这不仅增加了引物的特异性和稳定性,也对前人的方法进行了改进。（3）首次进行了椰子SSR分子标记向棕榈科不同属植物的转移扩增研究。用开发的10对椰子SSR引物对39份不同属的棕榈科植物进行扩增,有效扩增率高达90.5%,且在各属物种间多态性明显。（4）用开发出来的椰子SSR引物对42份国内外椰子种质材料采用UPGMA进行聚类分析,在相似系数为0.73处可划分为7个类群。（5）供试的42份国内外椰子种质材料的遗传相似系数范围大部分在0.6-0.8之间,最小为0.503,最大为0.961。（6）供试的不同来源的5个高种和8个矮种椰子种质材料中,高种的多样性高于矮种。（7）供试的海南高种椰子的遗传差异较小。（8）从DNA水平上能够将红矮和黄矮两个椰子品种准确地区分。（9）本研究利用SAM法开发了椰子特异性SSR标记84个,不仅填补了国内没有椰子SSR分子标记开发研究的空白,而且从数量上也比国外所报道开发的椰子SSR标记多。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 1.前言
• 1.1 椰子的生物学特性及经济意义
• 1.2 世界椰子业生产贸易概况
• 1.2.1 世界椰子生产概况
• 1.2.2 世界椰子贸易情况
• 1.3 椰子种质资源研究概况
• 1.3.1 形态学分类
• 1.3.2 同工酶研究
• 1.3.3 分子标记研究
• 1.4 SSR分子标记的的研究概况
• 1.5 SSR分子标记的开发
• 1.5.1 EST-SSR方法
• 1.5.2 实验生物学方法
• 1.5.3 转移扩增方法
• 1.6 开发椰子SSR标记的目的及意义
• 1.7 本研究的主要内容
• 1.8 本研究的技术路线
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 所用试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 SSR分子标记的开发
• 2.2.1.1 高质量基因组DNA的提取与检测
• 2.2.1.2 DNA样品限制性内切酶的消化和检测
• 2.2.1.3 基因组DNA样品的酶切与接头的连接
• 2.2.1.4 DNA样品的抑制性PCR（Suppression PCR）和检测
• 2.2.1.5 DNA样品的预扩增和检测
• 2.2.1.6 Selectively Amplified Microsatellite（SAM）扩增
• 2.2.1.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SAM扩增产物
• 2.2.1.8 从非变性聚丙烯酰胺凝胶上回收SAM扩增产物
• 2.2.1.9 二次SAM扩增及其产物的纯化
• 2.2.1.10 SAM扩增产物的克隆
• 2.2.1.11 克隆产物的测序
• 2.2.1.12 测序结果的分析
• 2.2.1.13 引物的设计与合成
• 2.2.1.14 多态性引物的筛选
• 2.2.1.15 椰子种质资源遗传多样性分析及聚类分析
• 2.2.1.16 椰子分子指纹图谱的构建
• 2.2.2 SSR标记通用性分析
• 3.结果与分析
• 3.1 椰子SSR分子标记开发的结果分析
• 3.1.1 基因组DNA的提取
• 3.1.2 DNA的酶切检测和抑制性PCR、预扩增产物的检测
• 3.1.3 Selectively Amplified Microsatellite（SAM）扩增结果分析
• 3.1.4 SAM扩增产物的回收、纯化与克隆
• 3.1.4.1 一次SAM扩增产物的回收及二次SAM扩增产物的纯化
• 3.1.4.2 纯化产物的克隆
• 3.1.5 克隆产物的测序结果分析
• 3.1.5.1 测序结果
• 3.1.5.2 SSR分析结果
• 3.1.6 特异引物的设计
• 3.1.7 多态性引物的筛选
• 3.1.8 应用开发出来的SSR标记对24份国内外椰子种质材料的退 传多样性分析
• 3.1.9 聚类分析
• 3.1.10 椰子分子指纹图谱的构建
• 3.2 SSR标记通用性分析结果
• 4.讨论
• 4.1 SAM法分离SSR标记的效率
• 4.2 SSR序列的分析
• 4.3 SSR特异引物的设计
• 4.4 多态性SSR引物
• 4.5 椰子SSR分子标记通用性
• 4.6 椰子的遗传多样性
• 5.结论
• 参考文献
• 附表1 部分SSR位点分析结果表
• 附表2 特异SSR引物情况表
• 附表3 SSR引物扩增结果表
• 附表4 42份椰子种质材料的遗传相似系数
• 致谢