论文摘要
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea（Hebert）Barr[无性世代为Pyricularia grisea（Cooke）Sacc]引起的世界性水稻病害,对水稻生产构成严重威胁。以各种抗病性的种质资源为基础,通过分子标记辅助（MAS）育种和基因工程（转基因）的手段,可以有效地将多个专化抗性基因转育到优良农艺性状已有品种中,从而加快育种进程,提高品种对稻瘟病的抗性,增强稳产性。黑壳子粳是一个来自于太湖流域对稻瘟病菌表现广谱高抗的地方水稻品种。按照图位克隆的技术路线,前期的研究工作将黑壳子粳上的抗稻瘟病基因定位到第11染色体RM7654和In5之间,命名为Pihk1（t）.为克隆到抗稻瘟病基因Pihk（t）,本文以黑壳子粳为材料构建基因组BAC文库。在Danial G. Peterson BAC文库构建方法的基础上,对实验步骤做了一些改进,建立了构建水稻基因组BAC文库的一套比较完整的体系。该文库以plndigo BAC5为载体,包含有39936个克隆。经酶切、电泳检测,平均插入片段为70Kb,按照水稻430Mb的基因组大小来估算,文库覆盖水稻基因组的6.5倍。以黑壳子粳基因组文库为基础,构建了便于PCR筛选的混合池。最初的文库为初级池,由104个384孔板组成,复制一份作为永久保存。将初级库的纵行合并为二级池,二级池横行合并为三级池。对三级池的所有混样菌液提取质粒,用Pihkl（t）紧密连锁的标记RM7654和In5通过PCR的方法,根据三维筛选体系筛选阳性克隆,获得4个该位点的阳性单克隆。阳性克隆经末端测序,根据测序结果设计引物进行染色体步移筛选邻近克隆,共获得6个阳性单克隆,重叠群覆盖基因组区间将近140Kb。挑选覆盖Pihk1（t）定位区间及其上游的克隆BAC No.242和BAC No.66P14进行基因组测序,以日本晴序列为参照,发现RM7654和In5之间黑壳子粳存在5Kb的插入,其中包含一个类似反转座子的序列,其对黑壳子粳的抗病效果可能产生影响。另外,定位区段预测到有两个具有抗病结构（NB-ARC）的候选基因,其中一个NB-ARC融合了WRKY结构域,这两个抗病结构基因可以用于之后的基因克隆。BAC克隆No.66P14测序结果表明标记RM7654上游存在30Kb的缺失,另有大于10Kb的插入,同时也有一个不同于日本晴的NB-ARC结构基因。