盾壳霉胞外蛋白酶特性、分离纯化及其生防作用评估

论文摘要

盾壳霉是防治核盘菌的重要生防菌。在盾壳霉寄生核盘菌的过程中会分泌多种胞外酶,包括葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶。前人已对盾壳霉产生葡聚糖酶和几丁质酶及其生防作用进行了许多研究,但对盾壳霉产生蛋白酶及其生防作用尚未见报道。为了明确蛋白酶在盾壳霉寄生核盘菌中的作用,本课题开展了对盾壳霉产生胞外蛋白酶的条件、盾壳霉蛋白酶基本酶学性质、蛋白酶分离纯化、以及蛋白酶粗提物对核盘菌菌丝和原生质体的作用效果等方面进行了研究。比较了马铃薯葡萄糖培养液（PDB）、马铃薯培养液（PB）、核盘菌菌核提取物培养液（Ss）、马铃薯菌核提取物培养液（PBSs）、马铃薯葡萄糖菌核提取物培养液（PDBSs）5种培养基对盾壳霉胞外蛋白酶产量影响。结果发现Ss培养液适合盾壳霉产生蛋白酶。结果还表明：葡萄糖不利于盾壳霉产生蛋白酶。采用福林酚法对盾壳霉胞外蛋白酶活性进行了定量测定,并研究了影响盾壳霉蛋白酶活性的因子。结果表明：盾壳霉蛋白酶活性最适温度为60℃,最适pH值为7。在40℃以下保存,蛋白酶稳定；一些金属离子,包括Na+、K+、Li+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+和Nn2+等（5mM）对盾壳霉蛋白酶酶活没有影响；而Fe2+（5 mM）对盾壳霉蛋白酶活性发挥具有明显的促进作用；当Fe2+浓度达到250 mM时,盾壳霉蛋白酶活性发挥受到显著抑制。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟（PMSF）非常敏感,说明盾壳霉产生的蛋白酶可能是一种丝氨酸蛋白酶。经过硫酸铵沉淀、透析后的样品,通过Q sepharose Fast Flow阴离子交换层析后,纯度有所提高,但仍未达到电泳纯,收集管中可以检测到蛋白酶的活性,为0.3U/ml,经过超滤,通过HiPrep 16/60 sephocryl s-100 High Resolution层析后,虽达到电泳纯,但未检测到蛋白酶活性,问题的原因还有待进一步探讨。经过Q sepharose Fast Flow层析收集液,检测到蛋白酶活性的收集管,处理核盘菌菌丝和原生质体,可以降解核盘菌的菌丝,也可以降解核盘菌的原生质体,说明盾壳霉产生蛋白酶在其重寄生过程中扮演重要角色。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 作物菌核病及核盘菌研究进展
• 1.1 作物菌核病的危害
• 1.2 核盘菌的形态特征及基本生物学特性
• 1.3 油菜菌核病的防治策略
• 2 生防菌盾壳霉的研究进展
• 3 盾壳霉寄生核盘菌机理研究进展
• 3.1 重寄生作用
• 3.2 抗生作用
• 4 蛋白酶的研究进展
• 4.1 蛋白酶的分类
• 4.2 蛋白酶的作用
• 5 蛋白质纯化技术
• 6 本研究的意义和主要研究内容
• 6.1 本研究的意义
• 6.2 主要研究内容
• 第二章 盾壳霉蛋白酶活性测定方法
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 蛋白酶的定性测定
• 1.5 蛋白酶的定量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白酶定性测定标准曲线的制作
• 2.2 蛋白酶标准品酶活测定
• 2.3 盾壳霉在PDB中液体培养产生蛋白酶的测定
• 3 讨论
• 第三章 盾壳霉胞外蛋白酶产酶条件研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 核盘菌菌核的制备
• 1.5 不同培养基对盾壳霉产生胞外蛋白酶的影响
• 1.6 不同培养天数对盾壳霉产生胞外蛋白酶的影响
• 1.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 核盘菌菌核的制备
• 2.2 不同培养基对盾壳霉产生胞外蛋白酶的影响
• 2.3 不同天数对盾壳霉产生胞外蛋白酶的影响
• 3 讨论
• 第四章 盾壳霉胞外蛋白酶酶学性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 盾壳霉胞外蛋白酶最适温度研究
• 1.5 盾壳霉胞外蛋白酶热稳定性研究
• 1.6 盾壳霉胞外蛋白酶最适pH研究
• 1.7 金属离子对盾壳霉胞外蛋白酶的影响
• 2+浓度对蛋白酶活性的影响'>1.8 不同浓度Fe²⁺浓度对蛋白酶活性的影响
• 1.9 抑制剂对盾壳霉胞外蛋白酶的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 盾壳霉胞外蛋白酶最适温度
• 2.2 盾壳霉胞外蛋白酶热稳定性
• 2.3 盾壳霉胞外蛋白酶最适pH
• 2.4 金属离子对盾壳霉胞外蛋白酶的影响
• 2+浓度对蛋白酶活性的影响'>2.5 不同浓度Fe²⁺浓度对蛋白酶活性的影响
• 2.6 抑制剂对盾壳霉胞外蛋白酶的影响
• 3 讨论
• 第五章 盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 盾壳霉胞外蛋白酶纯化
• 1.5 盾壳霉胞外蛋白酶酶谱试验
• 2 结果与分析
• 2.1 粗提液蛋白酶酶谱试验
• 2.2 Q sepharose Fast Flow阴离子交换层析结果
• 2.3 HiPrep 16/60 sephocryl s-100 High Resolution层析结果
• 3 讨论
• 第六章 盾壳霉胞外蛋白酶的生防作用
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 盾壳霉在寄生核盘菌菌核过程中产生胞外蛋白酶
• 1.5 经过Q sepharose Fast Flow层析收集液对核盘菌的作用
• 2 结果与分析
• 2.1 盾壳霉重寄生过程中胞外蛋白酶的产生
• 2.2 盾壳霉寄生灭菌核盘菌菌核胞外蛋白酶定性测定
• 2.3 经过Q sepharose Fast Flow层析收集液对核盘菌菌丝的作用
• 2.4 经过Q sepharose Fast Flow层析收集液对核盘菌原生质体的作用
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢