蚯蚓抗菌肽提取纯化及其性质研究

论文摘要

本实验以蚯蚓为原料,采用大肠杆菌诱导,通过电击的方式对抗菌肽的提取进行了探索和研究,结果表明:直接电击提取的蚯蚓液对大肠杆菌的抑菌圈直径19.7mm,效果最好;大肠杆菌诱导3h、4h、5h、6h的蚯蚓液对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为18.00mm、15.33mm、17.33mm、0mm,有随诱导时间延长抑菌效果逐渐降低的趋势;直接提取液、大肠杆菌诱导3h、4h、5h、6h的蚯蚓液对黄曲霉的抑菌圈直径分别为16.00mm、14.00mm、13.00mm、12.00mm、10.00mm,以直接电击提取液的抑菌效果最好,也呈随诱导时间延长抑菌效果逐渐降低的趋势;本次提取液对大肠杆菌抑菌圈直径明显大于国内相关报道（大肠杆菌的抑菌圈19.7mm:11.00mm、0mm、5.2～6mm）,且发现了蚯蚓提取液对黄曲霉有明显的抑菌作用（国内尚无报道）;蚯蚓提取液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌无抑菌作用;提取的粗液经Sephadex G-100层析提纯后对黄曲霉的抑菌作用降低（抑菌圈直径16mm:12 mm）;对大肠杆菌没有抑菌作用（抑菌圈直径19.7mm:0mm）;将蚯蚓提取物用SDS-PAGE电泳测出其蛋白质分子量主要在14.4～20.0KDa范围内,其中一条带的分子量在14.4KDa以下,说明该提取提取物为多肽。从而,认为采用大肠杆菌诱导,通过电击的方式可以提取具有抗黄曲霉和大肠杆菌的多肽,为利用蚯蚓提取抗菌肽粗液提供了一个成功的方法;发现了采用这种方法提取的蚯蚓液有很好的抗黄曲霉的作用,为解决黄曲霉对饲料污染与其对畜牧业的危害问题提供了一个新的线索;通过层析分离提纯会导致提取液抑菌效果的降低和消失,其方法还需进一步改进。

论文目录

• 图
• 表
• 英文缩略语
• 摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 蚯蚓养殖与常规利用
• 1.1.1 蚯蚓的生物学特性
• 1.1.2 蚯蚓的综合利用
• 1.1.2.1 蚯蚓是优质动物蛋白饲料
• 1.1.2.2 蚓烘是优质有机肥料
• 1.1.2.3 蚯蚓具有很高的药用价值
• 1.1.2.4 蚯蚓在环保中的应用
• 1.2 蚯蚓抗菌肽研究进展
• 1.3 抗菌肽类型
• 1.3.1 昆虫抗菌肽
• 1.3.2 两栖动物抗菌肽
• 1.3.3 哺乳动物抗菌肽
• 1.3.4 植物抗菌肽
• 1.3.5 细菌抗菌肽
• 1.3.6 病毒抗菌肽
• 1.4 抗菌肽的结构
• 1.4.1 α—螺旋型抗菌肽
• 1.4.2 β—折叠型抗菌肽
• 1.4.3 伸展性螺旋结构类
• 1.4.4 Loop型抗菌肽
• 1.5 抗菌肽的生物学功能
• 1.5.1 抗菌肽的抗细菌活性
• 1.5.2 抗菌肽的抗真菌作用
• 1.5.3 抗菌肽的抗病毒功能
• 1.5.4 抗菌肽的抗原虫作用
• 1.5.5 抗菌肽的抗肿瘤及癌细胞作用
• 1.5.6 促单核细胞趋化作用
• 1.5.7 抑制促肾上腺皮激素（ACTH）的作用
• 1.5.8 抑制蛋白激酶C的作用
• 1.5.9 促进创伤愈合作用
• 1.6 抗菌肽的作用机理
• 1.7 抗菌肽的应用前景
• 1.7.1 在畜牧业领域的应用
• 1.7.2 抗菌肽饲料添加剂的应用前景
• 1.8 本课题的研究意义及技术路线
• 1.8.1 研究的意义
• 1.8.2 研究的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 蚯蚓
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 培养基
• 2.1.3.1 牛肉膏汤培养基（大肠杆菌菌液培养用）
• 2.1.3.2 普通琼脂培养基（大肠杆菌培养用）
• 2.1.3.3 马铃薯培养基（黄曲霉培养用）
• 2.1.4 细菌的培养
• 2.1.4.1 大肠杆菌菌液的培养
• 2.1.4.2 金黄色葡萄球菌的培养
• 2.1.4.3 绿脓杆菌的培养
• 2.1.4.4 黄曲霉的培养
• 2.1.5 主要试剂及配制
• 2.1.5.1 主要试剂
• 2.1.5.2 试剂配制
• 2.1.6 主要试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 蚯蚓抗菌肽的提取
• 2.2.1.1 蚯蚓的选择和清洗
• 2.2.1.2 抗菌肽的提取诱导试验
• 2.2.1.3 蚯蚓体腔液的提取和制备
• 2.2.1.4 粗样品干燥
• 2.2.2 抑菌实验
• 2.2.2.1 打孔法测定蚯蚓提取液的抑菌活性
• 2.2.2.2 抗菌粗组分的制备
• 2.2.2.3 抗菌活性的测定
• 2.2.2.4 实验统计分析
• 2.3 蚯蚓抗菌肽粗品的纯化
• 2.3.1 Sephadex G-100凝胶层析装柱
• 2.3.2 柱平衡
• 2.3.3 上样及洗脱
• 2.3.4 样品收集
• 2.3.5 样品浓缩
• 2.3.6 抗菌活性测定
• 2.4 SDS-PAGE测定蚯蚓抗菌肽分子量
• 2.4.1 分离胶制备
• 2.4.2 浓缩胶制备
• 2.4.3 样品变性处理
• 2.4.4 加样
• 2.4.5 电泳
• 2.4.6 染色
• 2.4.7 脱色
• 3 试验结果
• 3.1 蚯蚓体腔液抗菌肽对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌抑菌活性的影响
• 3.2 大肠杆菌诱导对蚯蚓抗菌肽活性的影响
• 3.3 蚯蚓抗菌肽对黄曲霉抑菌活性的影响
• 3.4 蚯蚓提取液的纯化
• 3.4.1 电击提取液层析结果
• 3.4.2 诱导提取液导析结果
• 3.5 蚯蚓抗菌肽分子量测定结果
• 4 讨论
• 4.1 不同诱导时间和提取法对蚯蚓提取液抗大肠杆菌抑菌作用有影响
• 4.2 不同诱导时间和提取法对蚯蚓提取液抗黄曲霉作用有影响
• 4.3 蚯蚓提取液经层析纯化后抗菌作用减弱,其方法还需改进
• 4.4 蚯蚓提取液属于多肽物质
• 5 结论
• 参考文献
• 附录