论文摘要
背景：雪旺细胞（Schwann cell，SCs）是周围神经的主要结构和功能细胞，神经损伤后它对神经的再生和功能恢复起着重要的作用，是比较公认的种子细胞。然而SCs存在不足，如：自体来源的SCs在适当条件下难以获得大量的雪旺细胞，多次传代后其形态和功能改变，且需二次手术；而异体来源的SCs则存在免疫排斥反应等，因此有必要继续寻找更为有效的种子细胞。神经干细胞移植入缺损的周围神经后能够向雪旺细胞分化，改善神经再生的微环境，促进周围神经再生和功能恢复，而神经干细胞分化形成神经元并发出轴突支配受损神经的靶器官能防止靶器官萎缩，揭示了神经干细胞在修复周围神经损伤的广阔前景。神经上皮干细胞是较原始的神经干细胞，有巨大的神经元方向分化潜能，更适合修复损伤的神经通路。关于雪旺细胞对神经干细胞存活分化的影响已有初步研究，但雪旺细胞对神经上皮干细胞的影响以及雪旺细胞与神经上皮干细胞之间相互影响的结果鲜有报道。目的：周围神经损伤后的再生修复问题一直是创伤外科和神经科学关注的问题。雪旺细胞作为首选的种子细胞在应用上存在不足而受到限制。而神经干细胞修复周围神经损伤存在巨大的潜能，分化成特定的神经细胞以及类雪旺细胞样细胞后分泌细胞因子以及其他一些不明机制均促进神经再生。所以探索如何为损伤的周围神经提供有利的环境，如何获得足够量的雪旺细胞，如何促进NSC的存活和增加向SCs或神经元分化的数量，促进周围神经再生和功能恢复，以期为有效修复周围神经功能提供依据。在上述思想指导下，我们设计了本项实验：应用神经上干细胞与雪旺细胞体外共培养的方法，观察神经上皮干细胞存活、定向分化、雪旺细胞增殖及MBP表达的情况，旨在探求体外培养同时获得足够量雪旺细胞和较多神经元的最佳条件，为细胞移植修复周围神经损伤提供体外实验依据。方法：本课题从新生Wistar大鼠坐骨神经及臂丛神经分离雪旺细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液于5％CO2、37°C、饱和湿度的培养箱中培养、纯化，备用；从孕11.5d Wistar大鼠的胚胎神经管分离神经上皮干细胞，用含10ng／m1bFGF和1×B27的DMEM／F12无血清培养液培养备用。通过雪旺细胞与神经上皮干细胞联合培养，培养液分别为无血清的DMEM／F12（1：1），1％血清的DMEM／F12（1：1），5％血清的DMEM／F12（1：1），10％血清的DMEM／F12（1：1），每2d更换新鲜培养液，并分别将收集更换的上清液过滤作为条件培养液，-70℃保存。实验组培养液分别为收集到的0、1、5、10％血清条件培养液；对照组为0、1、5、10％血清DMEM／F12（1：1）培养液。1．定时于倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态，并用显微摄像系统采集图像记录。2．实验组神经上皮干细胞接种于置有预涂多聚赖氨酸的盖玻片的24孔板中，不同血清浓度的条件培养液培养，每2～3d换液，培养1周；对照组将神经上皮干细胞接种于预涂多聚赖氨酸的盖玻片上，用DMEM／F12（1：1）培养1周；取出盖玻片，固定，MAP-2、GFAP免疫荧光染色。每组选取4张盖玻片，每片随机取5个不同的视野，IPP图像分析软件计数同一视野中神经元及星形胶质细胞，统计分析各组神经元及星形胶质细胞的比例。3．雪旺细胞以105个／ml接种于多聚赖氨酸包被过的96孔板中，每孔100ul，各组分别设8个复孔，培养3d，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）15μl，继续培养4h后吸掉上清，用DMSO溶解结晶。然后将培养板放在Multiskan MK3酶标仪上，采用实验波长570nm，测定每孔OD值。4．雪旺细胞与神经上皮干细胞联合培养4周后提取细胞总蛋白，通过SDS-PAGE及Western-blot检测MBP表达情况；对照组为单独培养的雪旺细胞，阳性对照为成熟的周围神经组织。部分标本细胞免疫化学检测雪旺细胞MBP的表达。结果：1．神经上皮干细胞悬浮生长，并分裂增殖形成由十几个细胞组成的神经球，随着培养时间的延长，神经球中细胞数目不断增加，第5～6d可生长成大约几十个细胞组成的神经球。免疫细胞化学染色：球体nestin染色阳性，球周围有MAP2、GFAP染色阳性细胞。刚接种的原代Schwann细胞呈圆形，悬浮在培养液中，接种后6h大部分细胞贴壁，其中大部分细胞开始呈椭圆形，24h后变成双极，胞体饱满，立体感强，少数呈三角形，伸出三个突起。培养48～72h后，出现聚合现象，许多细胞聚合在一起呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏状排列，在细胞密度较低时，则聚集成堆，形成“细胞岛”，免疫细胞化学染色为S-100阳性；另一种细胞稍大，外形不规则，呈扁平状，突起短而多，核较浅，为成纤维细胞，所占比例较低。实验组中神经球贴壁较快，培养24h可见大部分神经球贴壁，培养36h可见自神经球迁出细胞，细胞形态大多圆形，胞体较饱满，突起细长的神经元可见二三级突起，大体形态与成熟神经元相似。神经球周围有细短突起伸出，随着培养时间延长，突起束状排列，雪旺细胞早期形态无明显变化，随着神经球中迁出的细胞增多，明场下可观察到在神经元的轴突局部呈双轨样结构，也有少数多个突起的细胞胞体呈不规则型。对照组中的神经球较少贴壁，且贴壁后的神经球周围迁出的细胞极少，生长状况较差，且随培养时间延长神经球贴壁不牢，其周围的细胞也逐渐减少，至培养1周，几乎无贴壁的神经球和细胞。2．通过细胞免疫荧光染色和图像分析观察到实验组神经元与星形胶质细胞比例为1.53：1，神经元形态成熟。随着血清浓度增加，神经元比逐渐降低。3．MTT实验结果显示：实验组及对照组中随血清浓度提高，雪旺细胞存活及增殖率显著增加；0％血清实验组较0％血清对照组更能促进雪旺细胞存活和增殖，而其余血清浓度对照组促存活增殖效果优于实验组（P＜0.01）。4．细胞免疫化学显示MBP：部分轴突局部出现阳性表达MBP，表明雪旺细胞能够在神经上皮干细胞分化形成的神经元的诱导下向成髓鞘雪旺细胞方向分化5．Westernb-lot显示：单独培养的雪旺细胞中未见表达，联合培养的细胞裂解后的上清液中有MBP存在，成熟的神经组织中MBP含量较多。结论：联合培养既有利于神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化，也有利于雪旺细胞存活和增殖，同时神经上皮干细胞与雪旺细胞联合培养能使雪旺细胞分化为成髓鞘雪旺细胞并表达MBP。