中药白英抗肿瘤作用及其活性成分的研究

论文题目: 中药白英抗肿瘤作用及其活性成分的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 药理学

作者: 孙立新

导师: 王敏伟,毕开顺

关键词: 白英,抗肿瘤活性,细胞凋亡,周期抑制,妊娠双烯醇酮,薯蓣皂苷元

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 白英是茄科（Solanaceae）植物Solanum lyratum Thunb．的干燥全草，主产我国长江以南各省区，具有清热解毒、祛风化痰、祛风湿等功效，用于治疗疟疾、黄疸、水肿、淋病、风湿关节炎、胆囊炎、癌症、子宫颈糜烂、白带、疔毒等。本文主要进行了白英粗提物体内外抗肿瘤作用、有效萃取物的筛选与体内抗肿瘤作用、活性追踪分离化学成分、活性单体化合物-16-妊娠双烯醇酮抗肿瘤作用的分子机制和白英中活性成分含量测定方法的建立等五个方面的研究。本文选取体外培养的人宫颈癌HeLa、人黑色素瘤A375、人乳腺癌MCF7、人肝癌Bel-7402、人胃腺癌SGC-7901、小鼠纤维肉瘤L929和人髓性白血病U937细胞为模型，以半数抑制浓度(IC50)为指标，采用MTT法考察了白英醇提物和水提物对上述肿瘤细胞的生长抑制作用，结果表明，白英醇提物和水提物对上述肿瘤细胞有显著的增殖抑制作用，呈明显的浓度-效应依赖关系；白英醇提物和水提物对各种肿瘤细胞的敏感性不同，其中对SGC-7901、A375、Bel-7402、HeLa、L929细胞的抑制作用较强，对MCF7、U937细胞的抑制作用较弱；对同一种肿瘤细胞白英醇提物的抑制作用明显高于水提物。体内以小鼠移植性肿瘤肝癌H22和肉瘤S180为模型，以抑瘤率为指标，考察了白英醇提物和水提物的体内抗肿瘤作用，结果表明，白英醇提物对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌均有较强的抑制作用，高剂量组荷瘤小鼠的平均瘤重明显低于阴性对照组，且抑瘤率大于40％；白英水提物对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌均有一定的抑制作用，高剂量组荷瘤小鼠的平均瘤重明显低于阴性对照组，抑瘤率大于30％，可初步认为白英有一定的抗肿瘤作用，且醇提物比水提物的作用强。白英醇提物和水提物对小鼠的急性毒性均很低。本文选取体外培养的人宫颈癌HeLa、人黑色素瘤A375、人乳腺癌MCF7、人肝癌Bel-7402、人胃腺癌SGC-7901和小鼠纤维肉瘤L929细胞为模型，以半数抑制浓度(IC50)为指标，采用MTT法对白英的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶性萃取物进行了活性筛选，结果表明，白英乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对上述肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用，且呈浓度-效应依赖关系；白英乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对各种肿瘤细胞的敏感性不同，其中对A375和HeLa细胞的抑制作用较强，对SGC-7901和MCF7细胞的抑制作用次之，对Bel-7402和L929细胞的抑制作用较弱；对同一种肿瘤细胞乙酸乙酯萃取物的抑制作用明显高于正丁醇萃取物；石油醚萃取物和水溶性萃取物对肿瘤细胞生长无抑制作用。以小鼠移植性肿瘤肝癌H22和肉瘤S180为模型，以抑瘤率为指标，考察了体外活性萃取物的体内抗肿瘤作用，结果表明，白英乙酸乙酯萃取物有较强的体内抗肿瘤作用，正丁醇萃取物的体内抗肿瘤作用较弱。本文选取体外培养的人宫颈癌HeLa和人黑色素瘤A375为模型，以半数抑制浓度(IC50)为指标，采用MTT法进行抗肿瘤活性追踪，利用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、制备薄层色谱和制备高效液相色谱等分离手段，从白英的乙酸乙酯萃取物分离出16个单体化合物，正丁醇萃取物分离出4个化合物，利用理化性质和光谱学技术，鉴定了15个化合物。其中2，8为新化合物，9为新天然产物，1，3为首次从该属植物中分离得到，4，7，12，14为首次从白英中分离得到。2个新化合物为：16-dehydropregnenolone 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranosiduronic acid（2），Diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosiduronic acid methyl ester（8）；13个已知化合物为：16-妊娠双烯醇酮（16-Dehydropregnenolone）（1），5α-孕甾烯醇酮（3-hydroxy-5-pregn-16-en-20-one）（3），原儿茶酸（Protocatechuic acid）（4），香草酸（Vanillic acid）（5），咖啡酸（Caffeic acid）（6），薯蓣皂苷元（Diosgenin）（7），Diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosiduronic acid（9），Diosgenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranosiduronic acid（10），Diosgenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-glucuroniduronic acid methyl ester（11），槲皮素（Quercetin）（12），芦丁（Rutin）（13），β-谷甾醇（β-sitosterol）（14），6-甲氧基-7-羟基香豆素（Scopoletin）（15）。采用MTT法测定了13个化合物对体外培养的人宫颈癌HeLa、人黑色素瘤A375、人肝癌Bel-7402和人胃腺癌SGC-7901细胞的体外抗肿瘤活性，结果表明化合物1，7，10，11，12有中等强度的体外抗肿瘤活性，其它化合物无活性。化合物1，10，11的体外抗肿瘤活性为首次发现。本文综合应用了细胞形态学、生物化学和分子生物学的方法对16-妊娠双烯醇酮（16-Dehydropregnenolone）诱导HeLa细胞凋亡机制进行了初步探讨。光学显微镜下观察30μM 16-妊娠双烯醇酮作用于HeLa细胞24 h后细胞体积缩小变圆，产生凋亡小体。30μM 16-妊娠双烯醇酮处理的HeLa细胞经Hoechst 33258荧光染色，显微镜下观察正常细胞全部蓝染，细胞壁完整，16-妊娠双烯醇酮30μM作用细胞24 h后，发现部分细胞发生染色体凝集和质膜出泡，同时可见已破碎的核，有的已形成凋亡小体，对比正常细胞致密的核可推断细胞经历了凋亡性的细胞死亡。在琼脂糖凝胶电泳实验中，30μM 16-妊娠双烯醇酮作用24 h后呈“阶梯状”图谱（DNA ladder），说明16-妊娠双烯醇酮可诱导HeLa细胞发生明显的DNA片段化，即诱导细胞发生凋亡。流式细胞分析结果显示：16-妊娠双烯醇酮处理后的HeLa细胞被阻滞于G0／G1期，且呈时间和浓度依赖关系；16-妊娠双烯醇酮作用于HeLa细胞可以检测到亚二倍体峰（Sub-G1），凋亡细胞数呈时间和浓度依赖关系，说明16-妊娠双烯醇酮是通过周期抑制和诱导细胞凋亡达到体外抗肿瘤作用。Western印迹实验结果表明：16-妊娠双烯醇酮作用于HeLa细胞后，caspase-3的酶原被降解，caspase-3抑制剂可部分抑制细胞死亡；16-妊娠双烯醇酮作用于HeLa细胞12h后caspase-3被活化，ICAD和PARP开始降解，24 h后DNA产生明显的有序化降解（DNA ladder），可知16-妊娠双烯醇酮诱导HeLa细胞凋亡时激活了caspase级联反应；在16-妊娠双烯醇酮诱导的HeLa细胞凋亡中，上调了促凋亡蛋白Bax的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2，使Bax／Bcl-2在药物作用后随时间延长而升高，此后caspase-3底物ICAD和PARP被降解，DNA发生片段化，表明16-妊娠双烯醇酮通过增加Bax／Bcl-2的比例，激活以线粒体为中心的信号转导途径而诱导细胞凋亡。本文以首次从白英中分离得到且具有抑制肿瘤细胞增殖活性的两个单体化合物薯蓣皂苷元和16-妊娠双烯醇酮为质控指标建立了高效液相色谱法。薯蓣皂苷元在0.04～0.2 mg·mL-1范围内呈良好线性关系（r=0.9999），平均回收率为104.5％（RSD=1.4％）；16-妊娠双烯醇酮在5.06～45.54μg·mL-1范围内呈良好线性关系（r=1.000），平均回收率为98.8％（RSD=1.7％）。该方法简便、快速、重复性好，可以作为白英质量控制的依据。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章绪论

1.1 天然药物抗癌活性成分研究进展

1.1.1 生物碱类活性成分

1.1.2 萜类活性成分

1.1.3 多糖类活性成分

1.1.4 苷类活性成分

1.1.5 蛋白类活性成分

1.1.6 蟾蜍甾二烯类活性成分

1.1.7 黄酮类活性成分

1.1.8 萘醌类活性成分

1.1.9 挥发油类活性成分

1.1.10 有机酸类活性成分

1.1.11 其它类活性成分

1.2 天然药物抗肿瘤作用机制研究进展

1.2.1 免疫增强作用

1.2.2 诱导肿瘤细胞分化

1.2.3 促进肿瘤细胞凋亡

1.2.4 影响拓扑异构酶

1.2.5 抗肿瘤血管生成

1.2.6 抑制微管蛋白活性

1.2.7 逆转多药耐药性

1.2.8 抑制端粒酶活性

1.3 白英的化学成分、药理作用及临床应用的研究进展

1.3.1 化学成分

1.3.2 药理作用

1.3.3 临床应用

1.4 立题依据

参考文献

第二章白英醇提物和水提物抗肿瘤作用的研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 白英醇提物和水提物及含药大鼠血清对肿瘤细胞增殖的抑制作用

2.2.3 白英醇提物和水提物最大给药量实验

2.2.4 白英醇提物和水提物对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌的抑制作用

2.3 实验结果

2.3.1 白英醇提物和水提物对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用

2.3.2 含白英醇提物和含水提物的大鼠血清对肿瘤细胞增殖的抑制作用

2.3.3 白英醇提物和水提物最大给药量实验

2.3.4 白英醇提物和水提物对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌的抑制作用

2.4 讨论

2.5 小结

参考文献

第三章白英有效部位的筛选及有效部位抗肿瘤作用研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 白英各部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用—抗肿瘤活性的体外筛选

3.2.2 白英有效部位最大给药量实验

3.2.3 白英有效部位对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌的抑制作用

3.2.4 统计处理

3.3 实验结果

3.3.1 白英各部位对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用

3.3.2 白英各部位最大给药量实验

3.3.3 白英各部位对小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌的抑制作用

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

第四章白英有效部位化学成分的研究

4.1 活性单体的追踪分离

4.1.1 有效部位的获得

4.1.2 乙酸乙酯部位中活性成分的分离纯化

4.1.3 正丁醇部位中活性成分的分离纯化

4.2 化合物的结构解析

4.2.1 新化合物的结构鉴定

4.2.2 已知化合物的鉴定

4.3 活性部位洗脱各部分和单体化合物对肿瘤细胞的抑制作用

4.3.1 实验材料

4.3.2 实验方法

4.3.3 实验结果

4.4 实验部分

4.4.1 实验仪器和材料

4.4.2 提取和分离

4.4.3 化学成分的光谱数据

4.5 讨论

4.6 小结

参考文献

第五章 16-妊娠双烯醇酮诱导人宫颈癌HeLa细胞死亡机制的研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 16-妊娠双烯醇酮对HeLa细胞生长抑制的影响

5.2.2 细胞形态学变化的观察

5.2.3 荧光染色

5.2.4 DNA片段化电泳

5.2.5 流式细胞分析法

5.2.6 Caspase-3蛋白酶抑制剂对16-妊娠双烯醇酮诱导HeLa细胞死亡的影响

5.2.7 Western印迹法

5.2.8 数理统计

5.3 实验结果

5.3.1 16-妊娠双烯醇酮诱导HeLa细胞死亡呈明显的时间和剂量依赖性

5.3.2 16-妊娠双烯醇酮诱导HeLa细胞凋亡的形态学变化

5.3.3 DNA电泳观察

5.3.4 16-妊娠双烯醇酮诱导HeLa细胞阻滞在G_0／G_1期

5.3.5 caspase-3抑制剂(z-DEVD-fmk)对16-妊娠双烯醇酮诱导细胞凋亡影响

5.3.6 16-妊娠双烯醇酮对procaspase-3及caspase-3底物ICAD、PARP的降解

5.3.7 16-妊娠双烯醇酮对Bax和Bcl-2表达的影响

5.4 讨论

5.5 小结

参考文献

第六章白英中薯蓣皂昔元和16-妊娠双烯醇酮定量方法的研究

6.1 白英中薯蓣皂苷元含量测定方法的建立

6.1.1 仪器、试剂与试药

6.1.2 色谱条件与系统适用性试验

6.1.3 对照品溶液的制备

6.1.4 供试品溶液的制备

6.1.5 标准曲线的制备

6.1.6 仪器精密度试验

6.1.7 重复性试验

6.1.8 回收率试验

6.1.9 样品测定

6.2 白英中16-妊娠双烯醇酮含量测定方法的建立

6.2.1 仪器、试剂与试药

6.2.2 色谱条件与系统适用性试验

6.2.3 检测波长的选择

6.2.4 对照品溶液的制备

6.2.5 供试品溶液的制备

6.2.6 标准曲线的制备

6.2.7 仪器精密度试验

6.2.8 重复性试验

6.2.9 回收率试验

6.2.10 样品测定

6.3 讨论

6.4 小结

参考文献

结论

缩略语

致谢

个人简历

附图

发布时间: 2006-12-14

参考文献

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