唾液酸近氨基端结构域功能及脂多糖对PRRSV诱导IFN-α的影响研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种猪的病毒性传染病。PRRSV在体内主要入侵单核/巨噬细胞,研究表明这与猪肺泡巨噬细胞上的病毒受体密切相关,唾液酸粘附素受体在PRRSV侵染PAM细胞的过程发挥关键作用。唾液酸粘附素受体胞外区参与PRRSV与PAM细胞的吸附,本试验通过研究唾液酸粘附素受体近氨基端第一个结构域在PRRSV侵染PAM细胞的过程中的作用,为探讨唾液酸受体对PRRSV的内吞作用打下基础;在自然条件下,猪感染PRRSV后往往继发感染副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性细菌病,革兰氏阴性菌在体内会产生大量的内毒素,内毒素在机体的抗病毒机制中所发挥的作用目前还不明确,通过研究LPS刺激健康PAM细胞及感染PRRSV的PAM细胞对IFN-α和病毒复制的影响,为进一步探讨细菌内毒素在诱导机体抗病毒免疫反应抑制中的作用打下基础。从健康猪肺收集PAM细胞,提取总RNA,设计1对唾液酸粘附素受体近氨基端第一个结构域的特异性引物。用RT-PCR方法扩增出其近氨基端的第一个结构域的基因片段,大小约为450bp,将这基因片段亚克隆到pET-32a载体中,构建重组表达质粒pET-Sn150。在IPTG的诱导下成功表达,获得了分子量大小约为36.6KD的重组蛋白Sn150,与预期的蛋白分子量相符;通过优化表达条件,大量表达重组蛋白,用尿素法对表达的蛋白进行纯化与复性。用纯化蛋白免疫小鼠,制备抗重组蛋白Sn150的多克隆抗体,经间接ELISA检测,效价为1:12800。将特异性多抗做免疫印迹,结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。根据GenBank收录的PRRSV和β-actin基因序列设计特异性引物,以β-actin为内参基因建立检测PRRSV的相对荧光定量方法,该方法扩增产物形成单一的特异性溶解峰,扩增特异性较好。在24孔细胞培养板上培养PAM细胞,6h后将鼠抗Sn150血清加入PAM细胞,封闭1h后接种PRRSV,分别培养6h、12h、15h、18h、24h后,收集细胞及上清,用建立的real-time PCR方法检测PAM细胞中的病毒的mRNA水平,同时用健康PAM细胞作阴性对照。结果显示,鼠抗Sn150特异性抗体封闭后试验组PRRSV mRNA水平在各个时间段比对照组相应时间段的PRRSV mRNA水平明显增高,抗Sn150的特异性抗体增强了PRRSV在PAM细胞内复制,表明PRRSV进入PAM的过程可能存在更复杂的调节机制。将含200个TCID50病毒液,接到24孔细胞培养板中的PAM细胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同时设接毒对照和正常细胞对照,分别培养6h、12h、15h、18h、24h后,收集细胞及上清,用建立的real-time PCR方法检测PAM细胞中的PRRSV mRNA复制拷贝数。结果显示,LPS刺激PRRSV感染的PAM细胞,与未刺激PRRSV感染的PAM细胞相比,可以使PRRSV转录水平达到顶峰的时间推迟,PRRSV mRNA水平轻微上调,说明LPS可以增强PRRSV在PAM细胞内的增殖。根据GenBank收录的IFN-α基因序列设计特异性引物,以β-actin为内参基因建立检测IFN-α的相对荧光定量方法,该方法扩增产物形成单一的特异性溶解峰,扩增特异性较好。将含200个TCID50病毒液,接到24孔细胞培养板中的PAM细胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同时设接毒对照和正常细胞对照,分别培养6h、12h、15h、18h、24h后,收集细胞及上清,用建立的real-time PCR方法检测PAM细胞中的IFN-αmRNA水平。结果显示,与PAM健康细胞对照组相比LPS诱导健康PAM细胞在不同时间段的IFN-αmRNA水平无显著变化,LPS刺激PRRSV感染的PAM细胞与未刺激的PRRSV感染的PAM细胞相比,IFN-α转录水平达到顶峰的时间推迟,并且IFN-αmRNA水平大幅度下调,说明LPS抑制PAM细胞产生IFN-α;PRRSV感染PAM后与健康PAM细胞相比IFN-αmRNA水平明显上调, PRRSV可以诱导PAM细胞产生IFN-α,试验表明,LPS可以诱导机体抗病毒免疫反应抑制。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 常用缩略词
• 文献综述
• 引言
• 试验一 唾液酸近氨基端结构域的原核表达及多克隆抗体制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验二 PAM 细胞唾液酸近氨基端结构域封闭实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 试验三 脂多糖对 PRRSV 诱导PAM 产生IFN-α的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• ABSTRACT
• 发表论文