低温菌启动子的功能解析

论文摘要

启动子是进行微生物基因操作的重要元件,前期我们利用一株耐冷低温沙雷氏菌Serratia fonticola strain MY1402为宿主建立了基本的遗传操作系统。经建库筛选后,初步筛选到七个具有低温启动子活性的片段。本研究工作主要针对这几个潜在的低温启动子进行进一步的解析与研究,将前期实验中构建的重组质粒pUE1、pUE2、pUE3、pUE4、pUE8、pUE9、pUE11通过电转化导入宿主细胞中,并检测了转化子在不同卡那霉素浓度与温度下的活性,结果显示这七个片段均具有常温（37℃）和低温（15℃）起始转录活性,活性的强度依次为p3>p9>p8>p1>pll>P4>p2,但在两个温度下其活性均无显著差别,初步表明这七个启动子对温度敏感性不高。其后,通过启动子在线预测网站对它们的核心序列进行了分析,对启动活性较强和片段大小较为合适的p1、p3口p8进行了实验验证,通过人工合成了理论预测的核心序列并连接到报告基因上游,通过卡那霉素筛选出具有启动子活性的重组子,对应预测的不同启动子核心片段分别为p1-1、p3-1、p3-3、p8-1、p8-4。将重组质粒转化宿主后,利用卡那浓度梯度,在37℃和15℃的培养温度下通过qRT-PCR对启动子核心片段的转录活性进行了精确的定量研究,结果表明预测的核心片段在37℃时,p1-1、p3-3和p8-1的活性分别为其对应完整启动子活性的72%、85%和81%。但当培养温度降低时,几乎所有预测的核心序列都丧失了活性,分别只有完整启动子片段的37%、41%和56%。为进一步检测核心序列的启动子活性,构建了以GFP为报告基因的探针质粒pUG,分别对p3、p8及其核心片段进行了检测,结果表明只有重组质粒pUGP3重组子有荧光产生,后续进一步对p3进行了分析。在预测的核心序列的基础上再分别向上下游延伸了100bp,尽量保留预测的核心序列上下游可能的一些与转录相关的起始元件,以精确地确定真正的启动子核心序列,经检测发现片段p3S1的重组子可产生荧光；将p3S1进一步拆分后得到了三个启动子片段p3S1-1、p3S1-2和p3S1-3。镜检后表明p3S1-1和p3S1-3产生荧光,最后将核心序列精确定位到129bp,同时还发现了一个只有20bp但是却能够决定p3启动子转录起始的关键序列。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 低温微生物
• 1.1.1 低温微生物的简介
• 1.1.2 国内外低温微生物研究现状
• 1.1.3 低温沙雷氏菌研究现状
• 1.2 低温启动子
• 1.2.1 细菌启动子的简介
• 1.2.2 研究启动子的意义与目的
• 1.2.3 低温菌启动子的研究进展
• 1.3 报告基因
• 1.3.1 报告基因的概述
• 1.3.2 报告基因的应用
• 1.3.3 报告基因的问题与展望
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 启动子活性的初步分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 试剂与仪器
• 2.2 技术路线
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 含启动子片段重组质粒的DH5α的卡那霉素耐受性实验
• 2.3.2 重组质粒转化MY1402
• 2.3.3 含启动子片段重组质粒的MY1402的卡那霉素耐受性实验
• 2.4 结果
• 2.4.1 含启动子片段重组质粒的DH5α的卡那霉素耐受性实验
• 2.4.2 重组质粒电转化MY1402
• 2.4.3 含启动子片段重组质粒的MY1402的卡那霉素耐受性实验
• 2.5 讨论
• 第三章 启动子核心序列的预测与验证
• 3.1 材料
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 质粒
• 3.1.4 试剂与仪器
• 3.2 技术路线
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 启动子核心序列的预测及分析
• 3.3.2 启动子核心序列的合成
• 3.3.3 含启动子核心序列重组质粒的构建
• 3.3.4 含启动子核心序列重组质粒的卡那霉素耐受性实验
• 3.3.5 MY1402重组子卡那霉素耐受性的荧光定量实验
• 3.4 结果
• 3.4.1 启动子核心序列的预测结果及分析
• 3.4.2 含启动子核心序列重组质粒的卡那霉素耐受性实验
• 3.5 讨论
• 第四章 pUG启动子探针质粒的构建和核心序列的再次验证
• 4.1 材料
• 4.1.1 培养基
• 4.1.2 菌株
• 4.1.3 质粒
• 4.1.4 试剂与仪器
• 4.2 技术路线
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 pUG探针质粒的构建
• 4.3.2 含启动子完整片段的pUG重组质粒的构建
• 4.3.3 含启动子核心序列的pUG重组质粒的构建
• 4.3.4 p3启动子核心序列的再验证
• 4.3.5 对表达绿色荧光蛋白重组子的初步定量实验
• 4.4 结果
• 4.4.1 pUG探针质粒的构建结果
• 4.4.2 含完整启动子片段pUG重组质粒的重组子的发光情况
• 4.4.3 含启动子核心序列的pUG重组质粒的构建
• 4.4.4 p3启动子核心序列的再验证
• 4.4.5 p3启动子核心序列的探索
• 4.4.6 表达绿色荧光蛋白重组子的初步定量结果
• 4.5 讨论
• 第五章 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录
• 附录B 实验药品与设备
• B.1 主要溶液及其配制
• B.2 主要仪器
• B.3 试剂及酶制品
• 附录C 符号说明