针对gG基因的牛传染性鼻气管炎病毒新型检测方法建立和应用

论文摘要

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR）是牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rrhinotracheitis viruses, IBRV）引起的牛的一种以上呼吸道炎症为主的,急性、热性、接触性传染病,临床表现以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征。本课题组前期研究建立了gG缺失的IBRV标记疫苗株,因此,本研究旨在建立配套的鉴别诊断方法。以奶牛IBRV-gG为靶基因设计引物,建立PCR鉴别检测方法；截短克隆表达和纯化了奶牛IBRV-gG基因,制备了IBRV-gG单克隆抗体与多克隆抗体,建立了检测牛IBRV-gG的双抗体夹心ELISA方法,同时对一株IBRV-gG单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记,建立了检测奶牛IBRV-gG的竞争ELISA方法。论文的主要结果如下：1.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gG基因设计特异性引物,建立了一种PCR技术,可快速检测牛传染性鼻气管炎病毒（bovine infectious rhinotracheitis virus, IBRV）,又可同时区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病毒。2.牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白基因的截短表达根据GenBank中已发表的IBRV gG基因序列（GenBank登录号：NC001847.1）,利用计算机软件辅助筛选出gG抗原性强且不含疏水区和信号肽的区域,并用DNAstar软件设计1对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒基因组DNA为模板,PCR扩增gG基因,克隆到T载体pMD18-T,通过酶切分析及测定序列鉴定正确后,亚克隆至原核表达载体pET-32a。3.抗牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白单克隆抗体及多克隆抗体的制备用纯化的IBRV和IBRV-gG重组蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的表达蛋白、IBRV野毒株和缺失IBRV-ΔgG分别包被酶标板进行间接ELISA法筛选,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得分泌抗IBRV野毒株的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞。Western-blot试验证明此单抗能特异性地与IBRV反应,与gG缺失IBRV-ΔgG不反应,用小鼠腹水生产的McAb的ELISA效价为1：51200。此单克隆抗体可以用于IBRV的鉴别检测,为我国牛传染性鼻气管炎控制计划的实施提供了工具。4.牛传染性鼻气管炎IBRV-gG检测夹心ELISA方法的建立将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）免疫BALB/c小鼠,分离免疫小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3D6,1E8和1F4三株可以稳定分泌抗IBRV-gG特异性单抗的杂交瘤细胞株,用纯化的IBRV免疫新西兰大白兔,按常规方法制备IBRV多抗。选用抗gG单抗3D6株包被ELISA板,用兔抗IBRV多抗作为捕获抗体,建立了IBRV双抗体夹心ELISA检测方法。用该ELISA方法分别检测IBRV、牛分支杆菌、牛支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性。5.牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-gG抗体检测竞争ELISA方法的建立用牛传染性鼻气管炎病毒gG基因片段原核表达产物免疫小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）标记的单抗3D6建立了竞争ELISA,旨在检测IBRV抗体。经实验确定抗原包被浓度为500ng/mL,待检血清最佳稀释度1：160,酶标单抗3D6工作浓度1：2000,牛传染性鼻气管炎疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 前言
• 1.1 牛传染性鼻气管炎病的发展史
• 1.2 流行病学
• 1.3 生物学特征
• 1.4 临床症状
• 1.5 牛传染性鼻气管炎的诊断方法
• 1.5.1 PCR法
• 1.5.2 鉴别诊断
• 1.6 牛传染性鼻气管炎的防控
• 1.6.1 单位疫苗
• 1.6.2 重组疫苗
• 第2章 牛传染性鼻气管炎病毒PCR方法的建立
• 2.1 研究目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 病毒
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 设计牛传染性鼻气管炎病毒gG基因引物并合成
• 2.2.2.2 病毒培养与毒价滴定
• 2.2.2.3 DNA模板的提取
• 2.2.2.4 RT-PCR
• 2.2.2.5 PCR反应体系
• 2.2.2.6 特异性鉴定
• 2.2.2.7 敏感性鉴定
• 2.2.2.8 临床样本
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PCR条件优化
• 2.3.2 PCR反应特异性测定
• 2.3.3 PCR反应敏感性测定
• 2.3.4 牛鼻拭子样品的检测
• 2.4 讨论
• 第3章 牛传染性鼻气管炎gG基因的截短克隆表达
• 3.1 研究目的意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.1.1 细胞、病毒
• 3.2.1.2 菌种及质粒材料
• 3.2.1.3 主要试剂和培养基配制
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 病毒增殖纯化及模板制备
• 3.2.2.2 引物设计与合成
• 3.2.2.3 截短gG基因的PCR扩增
• 3.2.2.4 PCR产物的回收纯化及克隆
• 3.2.2.5 表达载体的构建及原核表达
• 3.2.2.6 表达蛋白的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PCR扩增与克隆结果
• 3.3.2 IBRV-gG在大肠杆菌中的截短表达与纯化
• 3.3.3 western blot检测
• 3.4 讨论
• 第4章 抗IBRV-gG蛋白单克隆抗体和多克隆抗体制备的研究
• 4.1 研究目的意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.1.1 细胞和动物
• 4.2.1.2 培养基及主要试剂
• 4.2.1.3 培养基及主要试剂的配制
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 动物免疫
• 4.2.2.2 SP2/0骨髓瘤细胞活化
• 4.2.2.3 细胞融合
• 4.2.2.4 间接ELISA法阳性杂交瘤细胞筛选
• 4.2.2.5 有限稀释法杂交瘤细胞亚克隆
• 4.2.2.6 单克隆抗体的鉴定
• 4.2.2.7 单克隆抗体亚类的鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 免疫动物血清效价
• 4.3.2 细胞融合
• 4.3.3 杂交瘤细胞的筛选
• 4.3.4 小鼠腹水单克隆抗体效价的测定
• 4.3.5 多克隆抗体的生产和效价测定
• 4.3.6 杂交瘤细胞染色体数的检测
• 4.3.7 单克隆抗体的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 动物的免疫
• 4.4.2 细胞融合
• 4.4.3 杂交瘤阳性细胞株的筛选
• 4.4.4 杂交瘤细胞的亚克隆
• 4.5 小结
• 第5章 牛传染性鼻气管炎IBRV-gG双抗体夹心ELISA方法建立
• 5.1 研究目的和意义
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 主要试剂及材料
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 IBRV-gG抗原最佳稀释度测定
• 5.2.2.2 IBRV-gG单克隆抗体最佳工作浓度的确定
• 5.2.2.3 IBRV-gG多克隆抗体最佳工作浓度的确定
• 5.2.2.4 IBRV-gG夹心ELISA检测IBRV灵敏度与特异性
• 5.2.2.5 IBRV-gG夹心ELISA的应用
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 IBRV-gG sELISA检测IBRV-gG各条件的确定
• 5.3.2 IBRV-gG夹心ELISA操作步骤
• 5.3.3 IBRV-gG夹心ELISA检测IBRV灵敏度与特异性
• 5.3.4 IBRV-gG夹心ELISA的应用
• 5.4 小结
• 第6章 牛传染性鼻气管炎IBRV-gG竞争ELISA方法建立
• 6.1 研究目的和意义
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 方法
• 6.2.2.1 腹水的制备及单抗的纯化
• 6.2.2.2 制备酶标抗体
• 6.2.2.2 建立单克隆抗他竞争ELISA方法
• 6.2.2.3 特异性鉴定
• 6.2.2.4 用竞争ELISA和细胞毒性中和试验检测样品
• 6.2.2.5 用牛传染性鼻气管炎gB阻断ELISA检测试剂盒检测上述样品
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 IBRV-gG竞争ELISA检测IBRV-gG反应各条件的确定
• 6.3.1.1 抗原和抗体的浓度选择
• 6.3.1.2 血清最适合稀释度的选择
• 6.3.1.3 阴阳界线的确定
• 6.3.1.4 选择抗体稀释液
• 6.3.1.5 选择合适的封闭液
• 6.3.1.6 最佳竞争反应时间
• 6.3.2 IBRV-gG竞争ELISA检测的灵敏度与特异性
• 6.3.2.1 特异性鉴定
• 6.3.2.2 符合试验
• 6.4 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢