淫羊藿总黄酮调控HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞凋亡和再生的研究

论文摘要

背景：超过生理剂量的糖皮质激素长期应用造成下丘脑—垂体—肾上腺（HPA）轴抑制和肾上腺皮质萎缩。突然停药之后，易致肾上腺皮质功能不全，对机体内环境稳定甚至是生命存在潜在的威胁，为避免疾病复发和促进肾上腺皮质功能恢复，剂量递减仍是临床采用的唯一方法，但需要几个月甚至是1年以上的时间。因此，寻找新的方法拮抗糖皮质激素对HPA轴的抑制，促进肾上腺皮质功能恢复，是临床医学需要解决的重要命题。迄今国外还没有找到有效拮抗糖皮质激素对HPA轴抑制的药物。而根据课题组系列前期临床和实验研究，补肾复方及从补肾复方中精选出的单味中药淫羊藿、淫羊藿的提取物淫羊藿总黄酮（EF）能有效拮抗糖皮质激素对HPA轴抑制，保护肾上腺皮质功能。肾上腺皮质功能有赖于肾上腺皮质细胞的数量和功能。研究表明肾上腺皮质外侧存在干细胞，肾上腺皮质干细胞在外侧增殖、并向内侧迁移和分化从而形成肾上腺皮质各个功能层，依次为球状带、束状带、网状带，这种肾上腺皮质再生和另一个细胞生物学过程肾上腺皮质细胞凋亡共同调节了肾上腺皮质细胞的数量和功能。因此本研究拟从两个方面研究EF的作用机制。目的：1、EF对皮质酮诱导HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞过度凋亡的影响及分子机制。2、EF对皮质酮诱导HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质再生的影响及分子机制。材料与方法：动物：动物采用清洁级SD大鼠，雄性，4月龄。药物：EF采用辽宁产朝鲜淫羊藿，由上海市医药工业研究院中药室提取。方法：分为正常对照组、模型组、治疗组。模型组皮下注射皮质酮每天5mg／kg，连续14天。治疗组用EF灌胃，于造模前5天开始灌胃直至实验结束，剂量为每天0.06g／kg。①采用竞争结合免疫分析方法检测大鼠血浆皮质酮水平，以评价EF治疗对HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质功能的保护效果。②检测大鼠肾上腺重量和采用HE染色对大鼠肾上腺皮质进行组织学观察，以观察EF防治肾上腺萎缩的效果。③两种方法检测细胞凋亡，采用流式细胞术检测分离的肾上腺细胞凋亡率；并采用末端转移酶介导的X-dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测原位细胞凋亡。④两种方法检测细胞增殖，采用流式细胞术检测细胞周期分布；大鼠处死前1天腹腔注射BrdU，取肾上腺，BrdU免疫组织化学染色检测处于DNA合成期的细胞。⑤造模前1天大鼠腹腔注射BrdU以标记增殖细胞，14天后取肾上腺，采用BrdU免疫组织化学染色法观察增殖细胞的迁移情况；⑥采用基因芯片和实时定量PCR技术研究EF对细胞凋亡、增殖等过程发挥作用的分子机制。结果：1、各组大鼠血浆皮质酮水平：正常对照组、模型组、治疗组血浆皮质酮水平分别为：96.03±30.95ng／ml（n=16）、30.72±21.73ng／ml（n=16）、53.79±25.63ng／ml（n=24），模型组和正常对照组比较，血浆皮质酮水平显著减低（P＜0.01），治疗组和模型组比较，血浆皮质酮水平升高（P＜0.05）。表明EF能保护HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质功能。2、各组大鼠肾上腺重量和组织学检测：正常对照组、模型组、治疗组分别为49.63±6.00、28.88±9.45、34.97±4.84mg，模型组肾上腺重量与正常对照组比较显著下降（P＜0.01），治疗组与模型组比较显著升高（P＜0.05），同时HE染色显示EF使肾上腺皮质细胞密度增加，组织学改善。提示EF具有防止肾上腺萎缩的作用。3、细胞凋亡检测：流式细胞术结果正常对照组、模型组、治疗组细胞凋亡率分别为7.91±6.063％、14.42±4.851％、8.62±5.59％，模型组与正常对照组比较显著升高（P＜0.05），治疗组与模型组比较显著下降（P＜0.05）。TUNEL法显示正常对照组组、模型组、治疗组每张切片平均凋亡细胞数分别为4.67±1.53、70.67±9.29、18.67±7.64个，模型组与正常对照组比较显著升高（P＜0.05），治疗组与模型组比较显著下降（P＜0.05）。表明EF能明显降低皮质酮大鼠肾上腺皮质细胞过度的细胞凋亡。4、细胞增殖检测：流式细胞术检测细胞周期分布结果示正常对照组、模型组、治疗组处于G0／G1期细胞比例分别为76.36±1.93％、93.40±1.70％、85.70±2.62，与正常对照组比较，模型组显著升高（P＜0.01）；而治疗组与模型组比较显著降低（P＜0.01）。处于G2／M期的细胞比例三组分别为20.28±1.50％，2.86±1.73％，9.53±5.15％，与正常对照组比较，模型组显著降低（p＜0.01）；而治疗组与模型组比较显著升高（p＜0.01）。BrdU免疫组织化学染色结果显示阳性染色细胞位于外侧球状带；正常对照组、模型组、治疗组阳性染色细胞和细胞总数的比率分别为35.15±13.91％、、15.71±7.58％、48.52±10.59％，与正常对照组比较，模型组显著降低（p＜0.01）；与模型组比较，治疗组显著升高（p＜0.01）。表明EF能促进肾上腺皮质外侧区或细胞的增殖。5、增殖细胞迁移检测：造模前1天即给大鼠腹腔注射BrdU，对处于增殖状态的细胞进行标记，这些标记细胞随时间而迁移。以球状带和束状带的分界为界线，14天之后，BrdU免疫组织化学染色结果显示正常对照组和模型组的标记细胞均位于球状带，治疗组绝大部分标记细胞位于束状带／网状带。表明EF能促进被标记的增殖细胞向内侧迁移。6、EF减轻细胞凋亡和促进细胞周期、促进肾上腺皮质分泌功能的分子机制：采用美国Affymetrix公司Rat expression 230 2.0基因芯片，基因差异表达（上调或下调）两倍以上为有意义。发现模型组与正常对照组比较，上调的基因29个，下调的基因785个，反映皮质酮主要抑制肾上腺基因表达。其中有3个为凋亡相关基因：AMP-activated protein kinase alpha 1 catalytic subunit、inhibitor of apoptosis protein 1、baculoviral IAP repeat-containing 4，均具有抗凋亡活性；参与细胞周期的基因有6个，分别是neuroblastoma RAS viral（v-ras）oncogene homolog、nuclear factor I／A、forkhead box O1、v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog（avian）、fibroblast growth factor 7（FGF7）、interleukin 1 alpha，均具促进细胞周期活性。治疗组与模型组比较，上调的基因有237个，下调的基因有122个。其中有2个具抗凋亡活性的基因上调：mitogen activated protein kinase 8 interacting protein、insulin-like growth factorⅡ（IGF-Ⅱ）；有6个是促进细胞周期基因：FGF7、IGF-Ⅱ、mismatch repair protein、ret proto-oncogene、v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog（avian）、prostaglandin-endoperoxide synthase 2；有7个与皮质类固醇合成相关的基因上调：mevalonate kinase、mevalonate pyrophosphate decarboxylase、famesyl diphosphate farnesyl transferase 1、isopentenyl-diphosphate delta isomerase、2，3-oxidosqualene anosterol cyclase、cytochrome P450 subfamily 51、farensyl diphosphate synthase。基因表达谱的结果既在分子水平映证了EF减轻HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞凋亡的效果；也提示对细胞增殖、分化（多种类固醇合成酶基因上调）丛而对肾上腺皮质再生具有重要作用。基因表达谱检测结果显示EF明显上调IGF-Ⅱ和FGF-7的mRNA表达，根据文献，IGF和FGF家族与肾上腺皮质细胞表面受体结合后对肾上腺皮质细胞的增殖、分化、类固醇合成多个过程均具有重要的调控作用，因此是调节肾上腺皮质再生的重要上游分子；我们对其进行了进一步观察，分离正常大鼠肾上腺皮质细胞，直接与EF溶液孵育，实时定量PCR技术检测其基因表达。结果发现与EF共同孵育后，IGF-ⅡmRNA表达显著升高（P＜0.05）；而FGF-7mRNA表达无变化（P＞0.05）。综合基因芯片和定量PCR结果，IGF-Ⅱ和FGF7在体内实验（基因芯片检测）mRNA表达均显著上调；并且IGF-ⅡmRNA在体外实验（直接与EF溶液孵育）也被EF上调，表明IGF-Ⅱ和FGF-7均介导了EF促肾上腺皮质再生作用，但EF能直接诱导IGF-ⅡmRNA表达，可能对介导EF的作用更为重要。结论：通过对上述实验结果的分析，我们认为EF能通过干预以下两个细胞生物学机制拮抗糖皮质激素对肾上腺皮质功能的抑制：1、EF能减轻皮质酮诱导的HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞过度凋亡。2、EF能促进皮质酮透导的HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质再生。根据大量文献研究，BrdU标记细胞可认为是肾上腺皮质干细胞，我们采用完全相同的方法，观察到EF作用后BrdU标记细胞增殖活跃；更多细胞进入细胞周期；促进BrdU标记细胞向内侧迁移；多种类固醇合成相关酶基因表达上调。综上我们认为EF干预了肾上腺皮质干细胞的增殖、迁移、分化的各个过程，从而促进肾上腺皮质再生。两个重要的生长因子IGF-Ⅱ和FGF7虽以不同方式，但均介导EF促进再生的作用。拮抗糖皮质激素对HPA轴的抑制是亟需解决的重要问题，我们通过系列研究发现EF在此方面具有明确的效果，机制研究表明EF能拮抗皮质酮诱导的过度细胞凋亡，同时激活肾上腺皮质干细胞行为，促进肾上腺皮质再生，从而在根本上重建了腺皮质功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一、超生理剂量糖皮质激素应用导致HPA轴抑制
• 二、国内外拮抗糖皮质激素对PHA轴负反馈抑制,保护肾上腺皮质功能的研究。
• 三、糖皮质激素应用后肾上腺皮质的细胞生物学变化
• 材料与方法
• 一、动物分组及药物制备
• 二、大鼠血浆皮质酮检测
• 三、肾上腺皮质病理学检测
• 四、细胞凋亡检测:
• 五、细胞增殖检测:
• 六、肾上腺皮质增殖细胞迁移检测:
• 七、基因表达谱检测:
• 八、实时荧光定量PCR检测:
• 九、统计学方法
• 结果
• 一、各组大鼠血浆皮质酮检测
• 二、各组大鼠体重变化比较
• 三、各组大鼠肾上腺重量及重肾上腺重量指数（肾上腺重量/体重）比较
• 四、各组大鼠胸腺重量及胸腺重量指数（胸腺重量/体重）比较
• 五、组织学检测
• 六、流式细胞仪检测细胞凋亡率
• 七、原位TdT酶介导的dUTP缺口末端标记技术（in situ TUNEL）L检测细胞凋亡
• 八、细胞周期分布检测结果
• 九、BrdU免疫组织化学染色检测肾上腺皮质干细胞增殖
• 十、肾上腺皮质干细胞迁移检测
• 十一、基因表达谱结果
• 十一、实时定量PCR检测肾上腺皮质再生相关基因的表达:
• 讨论
• 一、EF能拮抗超生理剂量糖皮质激素对HAP轴的抑制,保护肾上腺皮质功能
• 二、EF抑制皮质酮诱导的肾上腺皮质细胞过度凋亡是其拮抗糖皮质激素对HAP 轴抑制的机制之一
• 三、EF促进肾上腺皮质干细胞增殖、迁移、分化,从而形成肾上腺皮质再生及 其分子机制
• 研究结论
• 1、EF能减轻皮质酮诱导的HAP轴受抑大鼠肾上腺皮质细胞过度凋亡
• 2、EF能促进皮质酮诱导的HPA轴受抑大鼠肾上腺皮质再生
• 结语
• 参考文献
• 附录 （一）综述
• 附录 （二）发表文章
• 致谢