阿霉素的微生物转化及dauU基因的阻断突变研究

论文摘要

阿霉素是柔红霉素C-14位羟化的衍生物，具有比柔红霉素更广的抗肿瘤谱和更小的毒副作用，在临床上作为一线抗肿瘤药物使用，主要用于多种实体瘤和急性白血病的治疗，仅阿霉素在世界范围内的市场已超过2亿美元。目前阿霉素的工业生产主要采用化学半合成法，从微生物发酵产生的柔红霉素出发须经过七步反应获得阿霉素，收率较低且污染环境。因此，研究酶法和微生物转化及生物合成直接生产阿霉素的新工艺将是技术进步和环境友好的必由之路。本研究对阿霉素合成的两种方法进行了探索，一是酶或微生物转化，即通过优化表达系统及引入DNR／DXR抗性基因来改善工程菌的阿霉素的产量；二是通过柔红霉素产生菌旁路代谢途径的阻断来研究对阿霉素合成的影响。 研究结果如下： 将来自天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的编码柔红霉素C-14羟化酶的doxA基因克隆至一高效表达载体pET32a中，构建了表达载体pYG914，Western blotting实验证明该融合蛋白在大肠杆菌中表达正确，SDS-PAGE电泳检测表达蛋白主要为包涵体。对包涵体复性和酶分离纯化条件进行了研究，最终获得了单一条带的目的蛋白。通过引入辅因子再生系统尝试体外酶法转化阿霉素，实验结果表明，由于所涉及的影响因素太多，大肠杆菌系统不适合阿霉素的转化。 通过PCR方法从SIPI-1482中扩增了含核糖体结合位点大小为1.3Kb的编码C-14柔红霉素羟化酶的doxA基因，编码SnpR蛋白的snpR基因及受SnpR调控的snpA启动子序列。与GenBank报道的来自链霉菌（S．sp．）C5的相关DNA序列比对表明，doxA基因和snpA启动子序列的同源性均为100％，而snpR的同源性为99.4％，氨基酸序列同源性为96.5％，有8个氨基酸的差异。 构建了三个链霉菌表达质粒pYG908、pYG915和pYG927，使得doxA基因分别在上游受SnpR激活的snpA启动子、红霉素抗性基因突变启动子（ermEp*）及诱导型启动子tipA控制之下，导入变铅青链霉菌（S．lividans）TK24获得了三株含doxA基因的工程菌。SDS-PAGE蛋白电泳证明，它们都能够表达大小约45KD的柔红霉素C-14羟化酶蛋白。工程菌发酵转化实验表明，它们都能将柔红霉素转化为阿霉素，其中，含pYG927／ET的工程菌的转化能力相对较强。对该工程菌发酵转化条件进行了初步研究，当底物（柔红霉素）浓度为2μg／ml时，工程菌的阿霉素产量为0.25μg／ml，转化率为12％。 为提高工程菌转化中底物的浓度，尝试将来自链霉菌S．peucetius ATCC 29050（另一株柔红霉素产生菌）的柔红霉素抗性基因之一drrC克隆至载体pYG934（含dnrV与doxA的串连片段）并导入变铅青链霉菌TK24，转化试验表明，含drrC的工程菌可在10μg／ml的底物浓度下进行转化，阿霉素的产量为0.3μg／ml，比2μg／ml底物浓度时的产量提高了

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 重要的蒽环类抗生素——柔红霉素和阿霉素概述
• 1.1.1 柔红霉素和阿霉素分子结构及性质
• 1.1.2 柔红霉素和阿霉素作用机理及用途
• 1.1.3 市场前景
• 1.2 阿霉素的合成方法
• 1.2.1 阿霉素的化学合成
• 1.2.2 阿霉素的生物合成
• 1.3 阿霉素生物合成的必要条件
• 1.3.1 外源基因doxA的特点（P450酶）
• 1.3.2 链霉菌表达系统
• 1.3.3 宿主耐受DNR和DXR的抗性机制
• 1.3.4 异源表达宿主系统
• 1.4 同源重组与基因交换
• 1.4.1 同源重组
• 1.4.2 基因交换
• 1.5 微生物转化及辅因子再生系统
• 1.5.1 微生物转化的特点
• 1.5.2 辅因子再生系统
• 1.5.3 微生物转化过程中的辅因子再生策略
• 1.5.4 辅因子再生实例
• 1.6 本课题的立题意义和研究内容
• 第2章 doxA基因在大肠杆菌中的克隆、融合表达及酶的纯化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与缓冲液的配制
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2法）'>2.2.2 大肠杆菌质粒转化（CaCl₂法）
• 2.2.3 大肠杆菌质粒提取
• 2.2.4 DNA片段的回收
• 2.2.5 重组大肠杆菌培养条件
• 2.2.6 亲和层析
• 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳
• 2.2.8 Western blotting
• 2.2.9 菠菜样品处理
• 2.2.10 酶活反应体系
• 2.3 结果
• 2.3.1 高效表达载体pYG914的构建
• 2.3.2 重组蛋白的表达
• 2.3.3 重组蛋白的验证
• 2.3.4 重组蛋白包涵体的复性和纯化
• 2.4 实验讨论
• 2.5 小结
• 第3章 doxA基因在链霉菌表达系统中的表达及发酵产物的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要溶液和缓冲液
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种的培养和保藏
• 3.2.2 链霉菌基因组DNA的提取
• 3.2.3 小片段tipA的回收
• 3.2.4 链霉菌原生质体制备
• 3.2.5 链霉菌质粒转化
• 3.2.6 链霉菌质粒提取
• 3.2.7 变铅青链霉菌的培养和菌丝体破碎
• 3.2.8 CO结合差光谱分析
• 3.2.9 重组菌发酵实验
• 3.2.10 HPLC分析条件
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 doxA基因及snpR+snpA的PCR扩增及序列测定
• 3.3.2 启动子为snpA的表达质粒pYG908的构建
• 3.3.3 启动子为tipA的表达质粒pYG915的构建
• *的doxA基因表达质粒的构建'>3.3.4 启动子为ermEp^*的doxA基因表达质粒的构建
• 3.3.5 重组菌蛋白表达
• 3.3.6 重组菌蛋白的CO吸收实验
• 3.3.7 重组菌对柔红霉素的转化
• 3.3.8 阿霉素浓度标准曲线
• 3.3.9 重组菌转化条件的研究
• 3.4 实验讨论
• 3.5 小结
• 第4章 柔红霉素抗性基因drrC在链霉菌中的克隆、表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 培养基和试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 链霉菌基因组DNA小量提取
• 4.2.2 出发菌株TK24对DNR的最高耐受浓度
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 TK24对柔红霉素的抗性实验
• 4.3.2 扩增drrC的引物序列
• 4.3.3 PCR扩增drrC
• 4.3.4 重组质粒的构建
• 4.3.5 TK24（pYG937）对柔红霉素的耐受程度
• 4.3.6 发酵产物的研究
• 4.4 实验讨论
• 4.5 小结
• 第5章 天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中酮还原酶基因dauU的敲除及发酵产物的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 dnrV+dauU+dauA（g）的PCR扩增
• 5.2.2 重组质粒pYG926的构建
• 5.2.3 重组质粒pYG926的酶切验证
• 5.2.4 dauU基因的测序
• 5.2.5 同源重组
• 5.2.6 敲除菌的验证
• 5.2.7 发酵产物的研究
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 综述报告和发表文章
• 附录