ESAT-6、CFP-10及rCFP10-ESAT6在艾滋病合并结核杆菌感染诊断价值中的研究

论文摘要

目的构建结核重组抗原ESAT-6、CFP-10及融合抗原rCFP10-ESAT6原核表达载体,经IPTG诱导表达,并在大肠埃希菌进行原核表达。获得纯化的蛋白产物,通过检测三者作为抗原刺激物在HIV感染者中的特异性T细胞反应,为建立艾滋病合并结核感染的诊断方法提供科学的实验依据。方法应用融合PCR（Fusion PCR）技术,从结核分枝杆菌基因组（HB37v）中成功克隆获得ESAT-6、CFP-10基因及rCFP10-ESAT6融合基因,连接到pGEM-T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a（+）和pET-28a（+）中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白及融合蛋白;通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western blotting免疫印迹分析、酶联免疫吸附试验（ELISA）证实表达蛋白抗原特异性;并将三种纯化好的表达蛋白作为抗原,以健康者、确诊的活动性结核患者分别作为阴性对照、阳性对照,采用酶联免疫斑点技术（enzyme-linked immuno-spot,Elispot）检测HIV感染者中特异性T细胞反应,通过患者外周血干扰素-γ分泌量的测定,判断其是否合并结核杆菌感染。结果本实验运用原核表达系统成功表达了结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10及rCFP10-ESAT6。pET-32a（+）-ESAT6以包涵体形式表达,重组蛋白分子量为31kD,表达蛋白约占菌体总蛋白的42%;pET-32a（+）-CFP10、pET-28a（+）-rCFP10-ESAT6以可溶性形式表达,重组蛋白分子量分别为33kD和28kD,表达蛋白分别占菌体总蛋白的73%、48%;经过确诊结核患者血清的Western blot、ELISA等方法检测均证实三者具有良好的抗原性。利用外周血单核细胞Elispot方法进行检测,结果显示斑点形成单位数（SFU/106 PBMC）在现症结核感染组和HIV合并结核感染组中显著升高,并与无合并结核感染的HIV组以及健康对照组间均存在显著性差异,有统计学意义（P<0.05）。无合并结核感染临床表现的HIV组部分患者也可检测出有非常高的斑点形成单位数。结论利用大肠埃希菌BL21（DE3）成功表达、纯化了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10重组蛋白和rCFP10-ESAT6融合蛋白,并以三种蛋白分别作为抗原刺激物,利用Elispot方法对HIV合并结核感染进行检测,为早期无结核病临床表现的潜在结核感染者的发现提供了可能,同时为艾滋病合并结核感染诊断平台的建立提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验技术概述
• 1 蛋白质表达系统
• 2 亲和层析纯化蛋白的原理和应用
• 3 酶联免疫斑点技术的原理及应用
• 第一部分 结核特异性抗原 ESAT-6、CFP10 及 rCFP10-ESAT6生物信息学分析及表达载体的构建
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 结核特异性抗原 ESAT-6、CFP10 及 rCFP10-ESAT6 基因在大肠埃希菌中的重组表达及其比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 结核抗原 ESAT-6、CFP10 及 rCFP10-ESAT6检测艾滋病合并结核杆菌感染中特异性 T 细胞反应
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结与展望
• 文献相关综述
• 正文
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢