香蕉小G蛋白基因MaROP1转化拟南芥的初步研究

论文摘要

ROP（Rho-related GTPases from plants）蛋白作为高等植物体内广泛存在的一类GTP结合蛋白,是一类重要的信号分子,在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。利用抑制差减杂交分离香蕉果实采后差异表达基因时获得了一个香蕉ROP基因,将其命名为MaROP1。该基因具有一个完整的开放阅读框,编码196个氨基酸,具有保守的ROP结构域,Blastx表明该基因与其它物种的ROP基因的同源性较高。实验室前期结果表明,该基因在香蕉基因组中的拷贝数较低,在香蕉的根、球茎、叶、花、果实中差异表达且在香蕉球茎中的表达量最高。为了深入研究MaROP1基因对逆境和激素的应答,本实验构建了MaROP1基因的融合植物表达载体pCAMBIAl 302-MaROP1,通过根癌农杆菌EHA105介导的花序浸蘸法将pCAMBIA1302-MaROP1植物表达载体转化哥伦比亚生态型野生拟南芥,经过35ug/mL潮霉素筛选各代种子（T1-T3）获得了14个MaROP1转基因拟南芥纯合株系,southern杂交表明MaROP1基因已经整合到各转基因株系的基因组中,RT-PCR证实MaROP1基因在各转基因株系中转录水平上表达。利用其中5个经过Southern和RT-PCR鉴定的转基因株系进行盐、干旱等逆境处理和ABA.ACC处理。MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对盐胁迫抵抗能力增强。在不同浓度的NaCl培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,200mM NaCl处理下野生型萌发率为23.42%,各转基因纯合株系发芽率在46.21%-79.76%之间。根长被抑制程度较低,150mM NaCl处理下,野生型平均根长为0.29 cm,各转基因纯合株系平均根长在0.57-0.79cm之间。对野生型和各转基因拟南芥成苗进行高盐胁迫后发现,MaROP1转基因拟南芥的存活率大于野生型,300mM NaCl处理14天后,野生型的存活率几乎为零,而各转基因拟南芥存活率均在30%以上。MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对干旱胁迫抵抗能力增强。在不同浓度甘露醇模拟干旱的培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,在400mM甘露醇培养基上野生型发芽率为23.12%,各转基因拟南芥发芽率在73.83%-85.00%之间。根长被抑制程度较低,在400mM甘露醇培养基中上野生型的根长几乎为零,而各转基因株系的根长仍然在1.00-1.42 cm之间。对野生型和各转基因拟南芥的离体叶片进行失水率测定发现,野生型离体叶片失水率明显高于各转基因株系,第240min时,野生型失水率为38.07%,而各转基因株系叶片离体失水率在22.04%-29.43%之间,说明各转基因拟南芥离体叶片在干旱胁迫下保水能力较高。对野生型和各转基因拟南芥进行干旱胁迫后发现,MaROP1转基因植株的存活率大于野生型,野生型的存活率为16%,而各转基因株系存活率在35%-65%之间。MaROP1转基因拟南芥与野生型相比降低了对ABA的敏感性。种子在胚胎萌发后期,产生大量内源ABA抑制种子萌发,本实验将刚收获的野生型和各转基因拟南芥播于MS培养基上,不经春化,按时间梯度统计萌发率,观测内源ABA对种子休眠的影响,结果发现各转基因拟南芥与野生型相比萌发速率较快,说明内源ABA对MaROP1转基因拟南芥的抑制作用低于野生型。外源ABA抑制种子萌发,在不同浓度外源ABA的处理下,各MaROP1转基因拟南芥种子发芽率均大于野生型,在5uMABA培养基上,野生型萌发率为38.77%,各转基因株系发芽率在54.62%-70%之间。在不同浓度外源ABA的处理下垂直培养和平放培养野生型和各转基因株系均表明,外源ABA对各转基因株系根长和生长速率的影响均比野生型小。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 香蕉概述
• 1.1.1 香蕉的分类地位及种类
• 1.1.2 香蕉的生物学特性
• 1.1.3 香蕉的经济价值
• 1.1.4 香蕉抗逆品种改良的重要性
• 1.2 小G蛋白Ras超家族ROP研究进展
• 1.2.1 ROP与G蛋白
• 1.2.2 ROP的结构与分类
• 1.2.3 ROP的信号通路
• 1.2.3.1 GAP（GTPase activating Proteins,鸟苷酸激活蛋白）
• 1.2.3.2 GDI（GDP dissociation inhibitor,鸟苷酸解离抑制因子）
• 1.2.3.3 GEF（GDP exchange factor,鸟苷酸转换因子）
• 1.2.3.4 ROP上游细胞质膜受体RLK（receptor-like kinase,受体样激酶）
• 1.2.3.5 ROP的下游效应因子
• 1.2.3.5.1 RIC（ROP-interactive CRIB-containing protein）
• 1.2.3.5.2 脂酰肌醇单磷酸激酶
• 1.2.3.5.3 NADPH氧化酶
• 1.2.3.5.4 尿核苷二磷酸葡萄糖转移酶（UGT1,UDP-glucose transferase）
• 1.2.3.5.5 乙酰基辅酶A还原酶（CCR,Cinnamoyl-CoA reductase）
• 1.2.3.5.6 组成型激活ROP互作子（ICR1,Interactor of constitutive activeROP1）
• 1.2.3.5.7 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK,mitogen-activated proteinkinases）
• 1.2.4 ROP的生物学功能
• 1.2.4.1 ROP调节花粉管生长
• 1.2.4.2 ROP调节根毛发育
• 1.2.4.3 ROP调控肌动蛋白细胞骨架和细胞极性
• 1.2.4.4 ROP与活性氧
• 1.2.4.5 ROP与次生壁合成
• 1.2.4.6 ROP参与植物激素应答
• 1.2.4.6.1 ROP参与脱落酸负调控
• 1.2.4.6.2 ROP调节生长素和油菜内酯素
• 1.2.4.6.3 ROP与乙烯
• 1.2.4.7 ROP参与逆境调节
• 1.2.4.7.1 ROP与非生物胁迫
• 1.2.4.7.1.1 ROP与盐胁迫
• 1.2.4.7.1.2 ROP与缺氧胁迫
• 1.2.4.7.1.3 ROP与高温胁迫
• 1.2.4.7.1.4 ROP与冷害胁迫
• 1.2.4.7.2 ROP与生物胁迫
• 1.2.4.7.2.1 ROP与水稻抗病
• 1.2.4.7.2.2 ROP与大麦抗病
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 技术路线
• 2 植物材料、试剂与仪器
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器
• 2.4 培养基的配制
• 3 方法
• 3.1 MaROP1基因系统发生分析、氨基酸序列比对、功能域分析
• 3.2 pCAMBIA1302-MaROP1植物表达载体构建
• 3.2.1 MaROP1插入片段的获得
• 3.2.1.1 引物的设计
• 3.2.1.2 目的片段的扩增
• 3.2.1.3 目的片段的回收
• 3.2.1.4 目的片段的酶切
• 3.2.1.5 目的片段的再次回收
• 3.2.2 pCAMBIA1302载体的获得
• 3.2.3 目的片段和pCAMBIA1302载体的连接
• 3.2.4 大肠杆菌E.coli.DH5a感受态细胞的制备和pCAMBIA1302-MaROP1转化E.coli DH5α
• 3.2.5 pCAMBIA1302-MaROP1质粒小量提取
• 3.2.6 pCAMBIA1302-MaROP1质粒酶切和PCR鉴定及测序
• 3.3 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备和pCAMBIA1302-MaROP1转化EHA105
• 3.4 MaROP1基因转化拟南芥
• 3.4.1 拟南芥培养
• 3.4.2 Dip法浸染野生型拟南芥花序
• 3.4.3 转基因拟南芥植株的潮霉素筛选
• 3.4.4 T1代抗性苗PCR检测
• 3.4.4.1 野生型和T1代抗性苗叶片总DNA的微量提取
• 3.4.4.2 T1代抗性苗PCR检测
• 3.4.5 MaROP1转基因拟南芥的Southern blot检测
• 3.4.6 各转基因纯合株系的RT-PCR分析
• 3.4.6.1 野生型和MaROP1转基因型拟南芥叶片总RNA的提取
• 3.4.6.2 cDNA第一链的合成
• 3.4.6.3 RT-PCR检测各转基因纯合株系MaROP1基因表达水平
• 3.5 盐胁迫对野生型和各转基因拟南芥株系的影响
• 3.5.1 NaCl对野生型和各转基因株系种子萌发率的影响
• 3.5.2 NaCl对野生型和各转基因株系根长的影响
• 3.5.3 NaCl处理野生型和MaROP1转基因株系成苗
• 3.6 干旱胁迫对野生型各转基因拟南芥株系的影响
• 3.6.1 甘露醇对野生型和各转基因株系种子萌发率的影响
• 3.6.2 甘露醇对野生型和各转基因纯合根长的影响
• 3.6.3 干旱处理野生型和各转基因株系成苗
• 3.6.4 野生型和各转基因株系叶片离体失水率测定
• 3.7 高温胁迫对野生型和各转基因拟南芥株系的影响
• 3.8 ABA对野生型和各转基因拟南芥株系的影响
• 3.8.1 内源ABA对野生型和MaROP1转基因株系种子萌发的影响
• 3.8.2 外源ABA对野生型和各转基因株系种子萌发率的影响
• 3.8.3 外源ABA对野生型和各转基因株系生长情况的影响
• 3.9 ACC对野生型和各转基因拟南芥株系根长的影响
• 4 结果
• 4.1 MaROP1基因推导的氨基酸序列结构分析
• 4.1.1 MaROP1与拟南芥AtROPs系统发生分析
• 4.1.2 MaROP1与拟南芥AtROP1-6氨基酸序列比对和功能域分析
• 4.2 pCAMBIA1302-MaROP1植物表达的构建
• 4.3 pCAMBIA1302-MaROP1转入根癌农杆菌
• 4.4 MaROP1转拟南芥纯合系的获得
• 4.4.1 潮霉素筛选压力的确定
• 4.4.2 T1代抗性苗筛选及PCR检测
• 4.4.3 T2代转基因植株潮霉素筛选的分离
• 4.4.4 T3代转基因纯合系的获得
• 4.4.5 MaROP1转基因T3代纯合株系的Southern检测
• 4.4.6 RT PCR检测转基因T3纯合株系MaROP1基因的表达
• 4.5 转基因T3纯合株系表型观测
• 4.5.1 野生型和各转基因株系开花期观察
• 4.5.2 野生型和各转基因株系叶片数、地上部分鲜重统计
• 4.6 盐胁迫对野生型和各转基因株系的影响
• 4.7 干旱胁迫对野生型和各转基因株系的影响
• 4.8 高温胁迫对野生型和各转基因株系的影响
• 4.9 ABA对野生型和各转基因拟南芥的影响
• 4.10 ACC对野生型和各转基因株系的影响
• 5 讨论
• 5.1 MaROP1植物表达构建和转化拟南芥
• 5.2 MaROP1转基因拟南芥对盐胁迫抵抗能力增强
• 5.3 MaROP1转基因拟南芥对干旱胁迫抵抗能力增强
• 5.4 MaROP1转基因拟南芥降低了对ABA的敏感性
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢