盐生杜氏藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆、表达以及功能鉴定

论文摘要

线粒体3-磷酸甘油脱氢酶（FAD-GPDH）是由核基因编码的蛋白，位于线粒体内膜的外表面，催化位点朝向细胞质，以3-磷酸甘油为底物，并通过其辅基FAD与呼吸链相连。它与细胞质3-磷酸甘油脱氢酶（NAD+-GPDH）一起组成3-磷酸甘油穿梭（glycerol-3-phosphate shuttle），在该穿梭中，细胞质3-磷酸甘油脱氢酶把NADH氧化成NAD+，同时还原糖酵解途径的中间代谢物——磷酸二羟基丙酮为3-磷酸甘油；随后，3-磷酸甘油穿过线粒体外膜，在内膜的外表面被线粒体3-磷酸甘油脱氢酶重新氧化成磷酸二羟基丙酮，脱下的两个电子由线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的辅基FAD传给辅酶Q，进入呼吸链传递，产生能量以供细胞的生长代谢需要。氧化生成的磷酸二羟基丙酮重新回到细胞质，进行下一轮循环或回到糖酵解途径。因此，3-磷酸甘油穿梭的实质就是把细胞质中NADH上的电子传到呼吸链，从而维持细胞质的氧化还原平衡。3-磷酸甘油穿梭普遍存在于真核生物中。在酵母和动物中3-磷酸甘油穿梭早有报道，且已有较深入的研究；但是直到最近才在拟南芥中发现线粒体3-磷酸甘油脱氢酶，并通过进一步实验证明植物中也存在3-磷酸甘油穿梭，除此之外再没有其它关于植物3-磷酸甘油穿梭的报道；至今未见任何有关藻类3-磷酸甘油穿梭的报道。盐生杜氏藻（Dunaliella salina，盐藻）是一种单细胞绿藻，能在很大盐浓度范围内生长，没有细胞壁，通过细胞膜伸缩改变细胞体积和调整细胞中的甘油浓度来适应不同的渗透环境。线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的底物——3-磷酸甘油，既是甘油合成的前体，同时也是合成细胞中甘油脂（包括膜脂和贮藏脂）必不可少的前体物质，所以研究盐藻细胞中3-磷酸甘油的代谢有利于更好地了解盐藻适应高渗环境的内在机制。因为生物体细胞在胁迫条件下，往往会导致细胞内NADH／NAD+比例的失衡，即氧化还原状态的失衡，所以对盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的功能和特性进行研究，可以为进一步窥探盐藻细胞的3-磷酸甘油穿梭及其在调节细胞中氧化还原平衡所发挥的作用奠定基础。本论文的内容包括盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶全长cDNA的克隆、对编码框蛋白质序列进行生物信息学分析、进行原核表达及体外功能鉴定、在转录和酶活水平上进行表达分析。取得成果具体如下：1、克隆了盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因全长cDNA：在盐藻cDNA文库中筛选获得线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因EST序列的基础上，进行3’RACE和5’RACE，获得了包括编码框序列、3’端非编码区及5’端非编码区的线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因全长cDNA序列。2、完成盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因编码框蛋白质序列的生物信息学分析：信号肽分析发现其N端具有导向线粒体的前导肽序列；跨膜结构分析发现氨基酸序列中有3个明显的跨膜结构域；把它与其它物种的线粒体3-磷酸甘油脱氢酶进行多序列比对发现，在保守区域具有FAD结合位点和3-磷酸甘油结合位点。3、进行盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的原核表达及体外酶活测定：把盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的编码序列构建到原核表达载体pET-32a上，然后在大肠杆菌BL21中高效表达，通过金属鳌和亲和层析纯化目的蛋白，进行体外酶活测定，结果发现重组蛋白能催化3-磷酸甘油的氧化，表现出线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的活性。4、分析了胁迫条件下，盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因在转录和酶活水平上的表达变化：荧光定量PCR和粗酶活测定结果一致表明，盐藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达受盐胁迫诱导，而受厌氧和冷胁迫的抑制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一章 盐生杜氏藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 藻种
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 试剂和试剂盒
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 盐生杜氏藻的培养
• 1.2.2 总 RNA的提取
• 1.2.3 总 RNA质量的检测
• 1.2.4 引物设计
• 1.2.5 DsFAD-GPDH基因3’端序列的克隆
• 1.2.6 DsFAD-GPDH基因5’端序列的克隆
• 1.2.7 测序
• 1.2.8 全长cDNA序列拼接
• 1.2.9 一般反转录 PCR
• 1.2.10 全长cDNA的编码序列的验证
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA的质量检测
• 2.2 DsFAD-GPDH基因cDNA的3’端序列克隆
• 2.3 DsFAD-GPDH基因cDNA的5’端序列克隆
• 2.4 DsFAD-GPDH基因全长cDNA序列的拼接
• 3 讨论
• 第二章 盐生杜氏藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因cDNA的生物信息学分析
• 1 分析方法
• 1.1 ORF分析及预测蛋白质的基本性质分析
• 1.2 序列相似性搜索
• 1.3 结构功能域预测
• 1.4 蛋白质序列的多重序列比对
• 1.5 蛋白质的信号肽预测
• 1.6 跨膜结构预测
• 1.7 辅基和底物结合位点识别
• 2 结果与分析
• 2.1 ORF分析及预测蛋白质的基本性质分析
• 2.2 序列相似性搜索及蛋白质序列的多重序列比对
• 2.3 结构功能域预测
• 2.4 信号肽预测
• 2.5 跨膜结构预测
• 2.6 辅基和底物结合位点识别
• 3 讨论
• 第三章 盐生杜氏藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因的原核表达、目的蛋白纯化及体外酶活测定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 酶制剂和试剂盒
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 层析柱子
• 1.2 方法
• 1.2.1 DsFAD-GPDH基因ORF的扩增
• 1.2.2 原核表达载体的构建
• 1.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
• 1.2.4 重组蛋白的表达
• 1.2.5 样品的制备和电泳
• 1.2.6 凝胶染色
• 1.2.7 亲和层析纯化
• 1.2.8 重组蛋白中咪唑的透析及蛋白浓缩
• 1.2.9 重组蛋白浓度的测定
• 1.2.10 重组蛋白的酶活测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ORF序列的扩增
• 2.2 原核表达载体的构建
• 2.3 重组蛋白的表达
• 2.4 重组蛋白表达条件的优化
• 2.5 重组蛋白的纯化
• 2.6 蛋白标准曲线制作
• 2.7 重组蛋白的体外酶活测定
• 3 讨论
• 第四章 盐生杜氏藻线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因在胁迫条件下的表达变化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 藻种
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 试剂和试剂盒
• 1.1.4 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 各种胁迫处理
• 1.2.2 总 RNA的提取及质量的检测
• 1.2.3 反转录反应
• 1.2.4 内参基因的选择
• 1.2.5 特异引物和内参引物的设计
• 1.2.6 引物的验证
• 1.2.7 荧光定量 PCR
• 1.2.8 荧光定量 PCR实验结果的处理
• 1.2.9 粗酶液的提取
• 1.2.10 蛋白浓度的测定
• 1.2.11 粗酶活的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 引物的验证
• 2.2 荧光定量 PCR的结果
• 2.3 蛋白标准曲线制作
• 2.4 粗酶活测定结果
• 3 讨论
• 结论
• 在读期间科研成果简介
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 酿酒酵母中细胞质 NADH的代谢
• 摘要
• 前言
• 1 线粒体外部 NADH脱氢酶
• 1.1 线粒体外部 NADH脱氢酶的物理性质、催化特性和调控机理
• 1.2 酿酒酵母nde1△nde2△双突变株的生理特征
• 2 线粒体3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油穿梭
• 2.1 酿酒酵母线粒体3-磷酸甘油脱氢酶基因（GUT2）的克隆
• 2.2 3-磷酸甘油穿梭的生理功能
• 3 线粒体外部 NADH脱氢酶与3-磷酸甘油穿梭的相对重要性
• 4 线粒体外部 NADH脱氢酶（Nde1p/Nde2p）对3-磷酸甘油穿梭的动力学调控
• 参考文献