论文摘要
第一部分机械牵张A549细胞对细胞活性和穿透素3表达的影响研究背景与目的大量资料证实了呼吸机所致肺损伤（VILI）与机械牵张应力有关,推测其可能机制是机械牵张对肺细胞的直接刺激触发、激活或启动细胞的牵张敏感基因高表达,其效应蛋白-细胞因子、炎症介质等大量产生,从而引发一系列的生物学反应,造成不同程度的生物学损伤。穿透素-3（PTX3）是一种急性期反应蛋白,也是一种炎症标志物,在炎症级联反应中均起着重要作用,并参与了机械牵张刺激引起的炎症反应过程,且它们基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3可能属于牵张敏感基因。本研究拟选择人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,从细胞力学的角度,研究A549在体外周期性机械牵张作用下细胞凋亡和细胞因子分泌的情况,以期为VILI发生机制提供新的理论依据,并为从细胞水平研究VILI提供一个合适模型。同时以该细胞模型为基础在细胞水平观察体外机械牵张对A549细胞PTX3表达的影响。方法本研究采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置FX4000T,该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜,形成负压而使培养膜拉伸应变,从而使黏附生长在膜上的细胞受到张力的作用,模拟机械通气对肺泡Ⅱ型上皮细胞的力学刺激,细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率（%）,加载程序由FX 4000计算机软件自动控制。对体外培养的A549细胞进行周期性牵张,观察不同机械力和不同牵张时间对细胞的影响。根据不同的处理方式分为静止对照组（C组）和机械牵张组（A组:6%应变率;B组:20%应变率）,A组和B组其他加载方案均为:频率0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为1h、2h、4h和6h)。静止对照组:应用“Flexstop”,即一个橡胶塞塞在BioFlex培养板的下面,阻止真空抽吸柔性细胞培养膜。采用Annexin V/PI检测细胞凋亡活性,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行检测,透射电子显微镜检测和Hoechst33258单染法荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态变化。同时应用ELISA法检测A549细胞细胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR检测肺泡上皮细胞PTX3 mRNA表达,Western blot检测PTX3蛋白水平。结果与C组相比,牵张1h以上B组A549凋亡和死亡细胞百分比显著增加（p<0.01）,而A组无显著差异（p>0.05）,其差异主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡细胞百分比没有显著差异（p>0.05）。B组呈时间依赖性地引起A549细胞凋亡,同时也促进细胞因子TNF-α分泌。与C组相比,B组细胞PTX3 mRNA表达和蛋白产生呈时间依赖性增加,B组被牵张2h引起PTX3 mRNA和蛋白表达显著增加,分别增加6.25倍和2.58倍（p<0.01）,而A组细胞PTX3基因的表达没有影响。结论体外过度机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549引起细胞凋亡和细胞因子TNF-α的分泌,并促进了PTX3表达,这可能在细胞力学水平为VILI提供了实验依据,同时也为后面从细胞水平研究VILI的发病机制提供了一个可行的模型。第二部分有效干扰A549细胞穿透素3表达的siRNA的筛选研究背景与目的RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术作为特异抑制基因表达的重要手段,已被广泛用于基因表达调控和基因功能的研究及基因治疗。其基本原理是通过是21-23个核苷酸的小片段,即siRNA特异性识别其互补mRNA,促使其降解,使相关基因处于转录后基因沉默,从而使细胞表现出特定基因缺失的表型。目前制备siRNA的方法有体外化学合成、体外转录、体内表达载体合成等,其中体外化学合成具有方便简单的特点。基于上述考虑,本研究旨在筛选有效抑制PTX3表达的体外化学合成的siRNA,从而为进一步探索其功能,并作为某些疾病的治疗手段提供理论依据。方法采用体外化学合成的方法,合成针对PTX3的siRNA各3对、阳性对照、阴性对照和荧光对照FAM-siRNA各1对,用脂质体2000转染A549细胞,用real-time PCR及Western-blot检测PTX3 mRNA和蛋白表达的水平。并转染荧光标记对照FAM-siRNA后,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染效率。结果脂质体2000将siRNA转染A549细胞的效率为89.18%±3.26%。与空白对照组相比,3对PTX3 siRNA均有效序列显著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,其中针对PTX3最有效siRNA能将PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而阴性对照组PTX3 mRNA和蛋白的表达均无显著差别（P>0.05）。结论化学合成的siRNA体外应用脂质体2000能高效转染A549,并筛选最有效干扰目的PTX3基因的siRNA,为进一步探索目的基因的功能提供理论依据。第三部分干扰穿透素3表达对机械牵张引起A549细胞活性改变的影响目的研究有效干扰PTX3基因表达对机械牵张引起A549细胞活性改变以及细胞因子释放的影响,探讨其在VILI中的可能作用。方法体外培养于包被胶原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培养板的人肺泡上皮细胞A549,随机分为空白对照组、静止对照组、牵张组、RNAi组、RNAi+牵张组。空白对照为未给任何干预正常培养细胞;静止对照组应用“Flexstop”阻止牵张;牵张组采用FX4000T细胞应变加载系统周期性牵张细胞,其方案为:应变率为20%,频率为0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为4h; RNAi组应用lipofectamineTM2000分别转染特异靶向PTX3的siRNA;RNAi+牵张组于牵张前12h转染特异靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法检测A549细胞PTX3 mRNA表达的变化;Western blot检测分泌PTX3蛋白;Annexin V流式细胞术检测A549细胞凋亡;ELISA法检测培养基上清中细胞因子TNF-α水平。结果与静止对照组相比,牵张组A549细胞PTX3基因和蛋白的表达显著上调,牵张组PTX3mRNA增加7.397±0.276倍（P<0.01）,牵张组和静止对照组PTX3蛋白分别为0.647±0.019和1.590±0.060（P<0.01）。而与牵张组相比, RNAi+牵张组细胞PTX3 mRNA和蛋白表达显著抑制。与静止对照组相比,牵张组早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比显著增加;而与牵张组相比,RNAi+牵张组成活细胞百分比明显增加（85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P<0.01）,凋亡细胞百分比明显降低。结论周期性机械牵张可通过上调人肺泡上皮细胞PTX3基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加和过度炎症反应,这一现象可能与VILI的发病机制有关。PTX3作为肺泡上皮细胞上表达的机械牵张敏感基因,从而积极参与了VILI的发病机制。第四部大潮气量机械通气大鼠肺部穿透素3的表达变化研究背景与目的呼吸机所致肺损伤（VILI）是机械通气的严重并发症之一。据统计,有22%～39%进行机械通气病人会发生VILI,死亡率高达15%～30%,严重影响患者预后。大潮气量机械通气时机械牵张应力作为一种炎症前期刺激,能通过特定的信号通路激起炎症级联反应,引起VILI。PTX3是新型的促炎症因子,在炎症级联反应中均起着重要作用,细胞水平研究结果显示,过度机械牵张能显著上调其表达,且基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3作为牵张敏感基因,可能在VILI的发病机制中起着重要作用。本实验拟研究大潮气量机械通气对大鼠肺部PTX3表达的影响。方法48只健康成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组（C组,n=16,保持正常自主呼吸）、保护性机械通气组（PV组,n=16,潮气量Vt:6ml/kg,PEEP=3～5cm H2O,呼吸频率为70次/分）、大潮气量机械通气组（HV组,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0）,呼吸频率为20次/分。其余通气参数均一致,即吸呼之比为1∶2 ,吸氧浓度FiO2为35%。颈动脉和颈内静脉切开置管,行监测、标本采集和液体及麻醉药的输注。持续检测HR、ECG、有创动脉血压（ABP）、直肠温度量监测。间断进行血气分析,计算氧合指数。机械通气4h后处死大鼠。（1）HE染色光学显微镜下观察各组肺组织病理学变化;（2）检测肺组织湿/干重比值（W/D）;（3）检测肺泡灌洗液和血清中蛋白计算肺通透指数（LPI）,ELISA法检测肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α;（4）测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性;（5）TUNEL法检测肺细胞的凋亡;（6）real-time PCR检测大鼠的肺组织中PTX3基因mRNA的表达水平;（7）免疫组化法检测肺组织PTX3蛋白的表达;（8）Western Blot检测肺组织PTX3蛋白的含量。结果（一）PV组与C组相比,肺损伤各项指标无显著改变。HV组通气4h PaO2显著降低（P < 0.05）,肺组织LPI、W/D和MPO活性均显著增加（P < 0.05）,组织病理学检测表现急性炎性损伤性改变。HV组大鼠肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α含量显著大于C组和PV组（P < 0.01）,而C组与PV组无显著差异（P > 0.05）。TUNEL法检测可见肺细胞凋亡改变。（二）与C组相比,HV组通气4h后PTX3基因mRNA和蛋白表达均显著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分别增加3.493倍和3.799倍;而PV组PTX3基因mRNA和蛋白表达均无显著改变（P>0.05）。结论大潮气量机械通气能导致肺损伤,而且显著上调了PTX3基因mRNA和蛋白表达水平,这可能与VILI的发生密切相关。
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- [1].不同潮气量对急性呼吸窘迫综合征病人肺损伤的影响[J]. 蚌埠医学院学报 2020(06)
- [2].利妥昔单抗致药物性肺损伤临床诊治分析[J]. 中国煤炭工业医学杂志 2017(03)
- [3].机械通气相关性肺损伤大鼠模型的建立与评价[J]. 中国当代医药 2016(06)
- [4].肺泡表面活性物质相关蛋白D与肺损伤[J]. 伤害医学(电子版) 2013(03)
- [5].13例含利妥昔单抗化疗方案致药物性肺损伤分析[J]. 中国医院药学杂志 2015(10)
- [6].药物性肺损伤三例[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2012(02)
- [7].百草枯中毒所致肺损伤的新药治疗研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2018(12)
- [8].先天性心脏病患儿围术期输血与术后肺损伤的相关性研究[J]. 现代生物医学进展 2018(11)
- [9].机械通气相关性肺损伤的预防及护理[J]. 世界最新医学信息文摘 2016(A0)
- [10].脓毒症相关性肺损伤的作用机制及研究进展[J]. 世界最新医学信息文摘 2016(21)
- [11].白羽肉鸡肺损伤的原因及其预防措施[J]. 家禽科学 2014(12)
- [12].清胰汤治疗急性坏死性胰腺炎肺损伤临床研究[J]. 中医学报 2013(10)
- [13].儿童系统性红斑狼疮性肺损伤治疗问题[J]. 中国实用儿科杂志 2012(10)
- [14].急性药物性肺损伤临床分析:附典型病例[J]. 中国全科医学 2009(20)
- [15].卡托普利对通气相关肺损伤的保护作用[J]. 第三军医大学学报 2009(21)
- [16].凋亡在原发性肺损伤中的变化[J]. 中国医药指南 2016(33)
- [17].小潮气量联合肺复张策略在重症肺炎肺损伤治疗中应用分析[J]. 中外医疗 2016(21)
- [18].科学知识图谱在自然科学中的探索——以肺损伤与修复为例[J]. 图书情报工作网刊 2012(05)
- [19].干细胞与肺损伤修复[J]. 临床肺科杂志 2009(05)
- [20].溺海肺损伤的发病机制和治疗的研究进展[J]. 中国急救医学 2008(03)
- [21].心脏不停跳大鼠单肺体外循环肺损伤模型的建立[J]. 中国现代医学杂志 2020(03)
- [22].沐舒坦对胸部创伤所致肺损伤的治疗作用[J]. 川北医学院学报 2015(06)
- [23].地西他滨致急性药物性肺损伤1例报告[J]. 生物技术通讯 2016(04)
- [24].姜黄素对机械通气相关性肺损伤的保护作用及其机制研究[J]. 重庆医学 2016(22)
- [25].白羽肉鸡肺损伤的原因及其预防措施[J]. 中国动物保健 2015(03)
- [26].常规通气和双水平正压通气方式治疗严重肺损伤的临床对比研究[J]. 临床急诊杂志 2015(07)
- [27].白羽肉鸡肺损伤的原因及其预防措施[J]. 养禽与禽病防治 2015(04)
- [28].丹参酮ⅡA磺酸钠对急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤的抗炎作用及其机制研究[J]. 胃肠病学 2014(06)
- [29].七氟烷对单肺通气肺损伤的保护作用及其机制[J]. 中国现代药物应用 2013(14)
- [30].丙泊酚对呼吸机所致肺损伤促分裂原活化蛋白激酶活化及炎症反应的影响[J]. 广东医学 2011(10)
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