新生小鼠视网膜光感受器前体细胞的培养和鉴定

论文摘要

在许多视网膜疾病中视网膜光感受器的损伤可导致不可逆的视力丧失,对此类疾病,临床上尚无有效的治疗方法。通过干细胞移植使其整合进视网膜并诱导其分化为目标细胞来修复这种损伤是目前最可行的方法之一,也是目前的研究热点。近年来,许多研究人员对胚胎干细胞（ESC）和成体干细胞中的间充质干细胞（MSC）、神经干细胞（NSC）和视网膜干细胞/祖细胞（RPC）用于视网膜细胞移植方面作了多方面的基础研究,取得了可喜的成绩和成果。然而,各类起源的干细胞移植入成年视网膜鲜有证据表明能整合进视网膜外核层、并分化为新的光感受器细胞、与其它神经元形成功能性的突触联系、或修复视功能。这可能是因为成熟的哺乳动物视网膜缺乏接受干细胞或促其向光感受器细胞分化的能力。在视网膜发育过程中,视网膜祖细胞不断增殖,并按一定的时空顺序分化成各种成熟的视网膜细胞,处于向视网膜光感受器细胞分化的个体生发中心后期的视网膜祖细胞,称之为视网膜光感受器前体细胞,处于此期的视网膜细胞应具有独特的生物学特征,将其作为移植的供体细胞,成功的可能会更高。目的:对新生小鼠视网膜光感受器前体细胞进行分离、体外培养,鉴定其性质,证实新生小鼠视网膜存在光感受器前体细胞、并具有神经干细胞的特性,具有分裂增殖能力和分化潜能,为进行视网膜光感受器前体细胞移植治疗视网膜光感受器损伤提供基础。方法:取同窝新生小鼠（生后1—7d）的视网膜,应用细胞培养技术,进行体外视网膜细胞培养、扩增,在倒置相差显微镜下观察其生长状况。通过细胞免疫组化和免疫荧光的方法,对视网膜光感受器前体细胞性质进行分析（Brdu、Nestin、Nrl、Opsin等标记物鉴定）。证实新生小鼠视网膜细胞中存在处于有丝分裂期并处于分化成成熟视网膜细胞前期的前体细胞,即视网膜光感受器前体细胞。结果:来自新生小鼠视网膜的细胞,在特定的培养基中能贴壁生长,传代后对培养细胞进行Brdu、Nestin、Nrl、Opsin荧光免疫组化标记,标记结果显示:（1）生长的大部分细胞为BrdU阳性细胞,表明贴壁生长传代的细胞主要是由分裂增殖的细胞组成。（2）培养细胞可表达神经干细胞的特异性抗原Nestin。表明培养的细胞具有神经干细胞特性。（3）培养的细胞能表达Nrl（神经视网膜亮氨酸链,有丝分裂后的视网膜光感受器所特有的转录因子,并持续存在在成年视杆细胞中）,且来自出生后3-4天的小鼠视网膜细胞中Nrl阳性细胞数达到高峰,表明培养细胞处于视网膜祖细胞向视网膜光感受器细胞分化的中间阶段,具有向视网膜光感受器细胞分化和表达视蛋白的潜能。（4）培养的细胞大部分不表达视紫红质opsin（视紫红质蛋白,成熟视网膜光感受器细胞所表达）,表明培养细胞处于未分化成成熟视网膜细胞的前期。结论:（1）新生小鼠视网膜处于光感受器细胞生发的高峰期,3-4天达到最高峰。（2）处于此期的新生小鼠视网膜细胞是处于个体生发中心后期并处于分化成成熟视网膜光感受器细胞前期的前体细胞,称为视网膜光感受器前体细胞。（3）视网膜光感受器前体细胞具有分裂增殖能力和分化潜能,而且已经表达转录因子Nrl,能促使其向成熟光感受器细胞分化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 新生小鼠视网膜光感受器前体细胞的培养和鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 干细胞移植治疗视网膜疾病的研究现状
• 综述参考文献
• 致谢