磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其在乳果糖制备中的应用

论文摘要

酶法制备乳果糖,是继化学法制备乳果糖之后的一条新途径。本论文主要包括磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶以及在两相体系中制备乳果糖两方面的研究,分为磁性壳聚糖微球的制备、固定化条件的优化、固定化酶的酶学性质及其在两相法制备乳果糖中的应用四个部分。采用共沉淀法制备磁流体。结果表明,当n(Fe2+):n(Fe3+)=1:1.75,反应温度为45℃,熟化温度为70℃,pH值大于10,反应时间为1.5 h的条件下,所得磁流体粒径分布均一,有较强的磁性。以甲醛为交联剂,采用反相悬浮聚合法制备磁性壳聚糖微球。研究结果表明,当Span-80为58%（v/v）,壳聚糖浓度为1.5%（w/v）,壳聚糖与四氧化三铁质量比为3:4,甲醛量为5%（v/v）,搅拌速度为1000 r/min时,所得磁性壳聚糖微球具有较高的酶固载量,适用于乳糖酶的固定化。以磁性壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,对乳糖酶进行固定化。研究结果表明,磁性壳聚糖微球溶胀的最适pH为7.0,时间为12 h。最佳的固定化条件为:乳糖酶的添加量1.6 U/mg载体,吸附时间30 min,戊二醛浓度0.2%（v/v）,交联5 h。获得的固定化乳糖酶的活力为420 U/g载体,酶活回收率为26%。固定化乳糖酶的最适反应温度为35℃,比游离酶高5℃;固定化乳糖酶的最适反应pH为8.0,比游离酶高1.5个单位。固定化乳糖酶的温度稳定性和pH稳定性比游离酶稍有提高。动力学常数Km为73.3 mmol/L （以邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷为底物）,较游离的乳糖酶（12.95 mmol/L）大,这说明该固定化酶对底物的扩散有一定的阻碍作用,与底物的亲和力减弱。在环己烷-水两相体系中,首先研究了单一乳糖酶反应制备乳果糖的条件,在此基础上研究了固定化乳糖酶和固定化葡萄糖异构酶制备乳果糖的条件。最佳条件为:在20mL环己烷-水（95:5,v/v）两相体系中,乳糖添加量为0.8 g/mL,果糖添加量为0.1 g/mL,固定化乳糖酶添加量为0.1 g,固定化葡萄糖异构酶添加量为0.05 g,反应温度为30℃,反应pH为8.0,反应时间为2 h。在最佳条件下,制得乳果糖的含量为151 g/L,是在水相中反应得到的乳果糖的三倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 乳果糖概述
• 1.1.1 乳果糖的理化性质和生理功能
• 1.1.2 乳果糖的应用
• 1.1.3 乳果糖国内外生产现状
• 1.2 乳糖酶研究历史和现状
• 1.2.1 乳糖酶的来源
• 1.2.2 乳糖酶的作用机理
• 1.2.3 乳糖酶的应用
• 1.3 固定化酶研究进展
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 酶的固定化方法
• 1.3.3 固定化乳糖酶的研究进展
• 1.3.4 磁性高分子微球在固定化酶中的应用
• 1.3.4.1 磁性高分子微球制备的方法
• 1.3.4.2 磁性高分子微球固定化酶的方法
• 1.4 非水相中的酶催化反应
• 1.5 立题背景及意义
• 1.6 本课题的研究内容
• 第二章 磁性壳聚糖微球的制备及表征
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验仪器
• 2.2.3 试验方法
• 2.2.3.1 磁流体的制备
• 2.2.3.2 磁性壳聚糖微球的制备
• 2.2.4 磁流体及磁性壳聚糖微球的表征
• 2.2.4.1 磁流体的粒径分布
• 2.2.4.2 IR 光谱分析
• 2.2.4.3 磁性壳聚糖微球结构的观察
• 2.2.4.4 磁性测定
• 2.2.4.5 磁性壳聚糖的表观密度
• 2.2.4.6 磁性壳聚糖的比表面积
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 磁流体的制备
• 2.3.2 磁流体制备条件优化
• 2+和Fe³⁺比例对磁流体磁性的影响'>2.3.2.1 Fe²⁺和Fe³⁺比例对磁流体磁性的影响
• 2.3.2.2 pH 值对磁流体磁性的影响
• 2.3.2.3 反应温度和熟化温度对磁流体磁性的影响
• 2.3.3 磁性壳聚糖微球的形态及结构
• 2.3.4 磁性壳聚糖微球制备的工艺优化
• 2.3.4.1 壳聚糖和四氧化三铁的比例
• 2.3.4.2 搅拌速度
• 2.3.4.3 乳化剂的添加量
• 2.3.4.4 甲醛的添加量
• 2.4 本章小结
• 第三章 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料和试剂
• 3.2.1.1 实验材料
• 3.2.1.2 试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 固定化方法
• 3.2.3.2 乳糖酶酶活测定方法
• 3.2.3.3 固定化酶酶活的测定方法
• 3.2.3.4 蛋白质含量测定
• m 的测定方法'>3.2.3.5 动力学常数K_m的测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 固定化条件的优化
• 3.3.1.1 pH 对磁性壳聚糖微球溶胀度的影响
• 3.3.1.2 给酶量对酶固定化的影响
• 3.3.1.3 吸附时间对酶固定化的影响
• 3.3.1.4 戊二醛的浓度对酶固定化的影响
• 3.3.1.5 交联时间对酶固定化的影响
• 3.3.2 固定乳糖酶的酶学性质
• 3.3.2.1 温度对固定化乳糖酶酶活的影响
• 3.3.2.2 固定化乳糖酶的温度稳定性
• 3.3.2.3 pH 对固定化乳糖酶酶活的影响
• 3.3.2.4 固定化乳糖酶的pH 稳定性
• 3.3.2.5 操作稳定性
• 3.3.2.6 固定化酶的动力学参数
• 3.4 本章小结
• 第四章 两相法制备乳果糖
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与试剂
• 4.2.1.1 实验材料
• 4.2.1.2 主要化学试剂
• 4.2.2 主要实验仪器
• 4.2.3 主要实验方法
• 4.2.3.1 固定化酶的制备
• 4.2.3.2 薄层层析条件
• 4.2.3.3 水相中乳果糖的制备
• 4.2.3.4 两相体系中乳果糖的制备
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 有机溶剂对乳果糖产量的影响
• 4.3.2 水含量对乳果糖产量的影响
• 4.3.3 单酶法产乳果糖
• 4.3.3.1 乳糖酶的添加量对乳果糖产量的影响
• 4.3.3.2 乳糖浓度对乳果糖产量的影响
• 4.3.3.3 果糖浓度对乳果糖产量的影响
• 4.3.3.4 温度对乳果糖合成的影响
• 4.3.3.5 pH 对乳果糖合成的影响两相体系
• 4.3.3.6 反应时间对乳果糖合成的影响
• 4.3.4 双酶法产乳果糖
• 4.3.4.1 温度对乳果糖产量的影响
• 4.3.4.2 pH 对乳果糖产量的影响
• 4.3.4.3 反应时间对乳果糖合成的影响
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文