利用拟南芥液泡膜Na～+/H～+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）改良马铃薯耐盐性的研究

论文摘要

土壤盐渍化已成为危害农作物生长、土壤荒漠化和自然生态环境恶化的主要原因之一。由于许多农作物是非耐盐的甜土植物，缺乏有效的耐盐机制，致使它们在盐渍化土壤上不能正常生长，甚至死亡。因此，培育具有经济价值的耐盐作物新品种，使其在盐渍化土壤上生长或在改良后的盐渍化土壤上生长，是有效利用广袤盐荒地的最佳途径。 随着植物耐盐机理深入探知，特别是耐盐相关基因的分离和功能的认知以及基因工程育种技术的成熟，开辟了培育耐盐植物品种的新途径，陆续获得了一些靠传统方法而不能获得的耐盐植物新品种（品系），在盐渍化土壤的利用上发挥着作用。植物细胞对盐胁迫的适应性主要是通过在细胞质中积累有机溶质、离子在液泡内区隔化和将过多的Na+通过质膜向细胞外排放等几方面的作用来实现的，其中Na1+的外排和区隔化是通过质膜或液泡膜上的Na1+／H+逆向转运蛋白来完成的，特别是Na+的区隔化可将进入细胞的无机离子吸收并储存在液泡中，使液泡更好地发挥其渗透调节功能，而成熟的高等植物细胞中液泡又占完全膨胀细胞总体积的95％。所以，Na+的区隔化是植物在盐环境下生存的必要保障，是较有机物质积累对植物耐盐所起作用更为有效的方式。 本研究的主要目的是从拟南芥中克隆液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白基因（AtNHX1），与组成型启动子CaMV 35S或逆境诱导型启动子rd29A融合，构建成不同启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。通过农杆菌介导，将CaMV 35S启动子驱动的AtNHX1基因转入洋葱表皮细胞和模式植物烟草中，以确证AtNHX1基因的功能。然后将携带目的基因的两种表达载体转入马铃薯中，从而提高其耐盐性。目前，取得的研究结果有： 1、以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料，用TRIzol一步法RNA提取试剂盒抽提总RNA，通过RT-PCR方法和DNA序列测定，证实获得了拟南芥Na+／H+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）的cDNA克隆。该cDNA全长1617bp，包括538个氨基酸编码区和1个终止密码，具有多个物种Na+／H+逆向转运蛋白基因的高度保守序列——氨氯砒嗪脒（amiloride）的结合位点（LFFIYLLPPI）和Asp137。序列同源性分析结果显示，该cDNA片段与原序列的同源性高达99.75％，与同科芸薹属油菜的同源性为89％，但与不同科植物的同源性较低，仅为60％～70％，表明该基因在进化上存在多样性，但它们都具有氨氯砒嗪脒结合位点，对Na+具有高度专一性，对植物的耐盐性起着重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 盐对植物的伤害及植物耐盐机理
• 1.1.1 盐对植物的伤害
• 1.1.2 植物耐盐机理
• 1.2 植物耐盐基因工程育种
• 1.2.1 转渗透调节物质基因工程
• 1.2.1.1 编码氨基酸合成的基因
• 1.2.1.2 编码季铵类化合物合成的基因
• 1.2.1.3 编码糖醇类化合物合成的基因
• 1.2.1.4 编码多胺类化合物合成的基因
• 1.2.2 转抗氧化酶基因工程
• 1.2.3 转逆境保护蛋白基因工程
• 1.2.3.1 渗透蛋白基因
• 1.2.3.2 晚期胚胎发育丰富蛋白（LEA蛋白）基因
• 1.2.4 转跨膜运输蛋白基因工程
• +、Na⁺运转及相关基因'>1.2.4.1 K⁺、Na⁺运转及相关基因
• +区隔化或外排及相关基因'>1.2.4.2 Na⁺区隔化或外排及相关基因
• 1.2.4.3 水分运输及相关基因
• 1.2.5 转信号传递基因和转录调控基因工程
• 1.2.5.1 信号传递基因
• 1.2.5.2 转录调控基因
• +/H⁺逆向转运蛋白及其在耐盐基因工程育种中的作用'>1.3 植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其在耐盐基因工程育种中的作用
• +/H⁺逆向转运蛋白的发现和基本特征'>1.3.1 植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的发现和基本特征
• +/H⁺逆向转运蛋白的发现'>1.3.1.1 植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的发现
• +/H⁺逆向转运蛋白的细胞和染色体定位及大小'>1.3.1.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的细胞和染色体定位及大小
• 1.3.1.3 SOS基因家族和AtNHX基因家族及与植物耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白的功能'>1.3.1.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性'>1.3.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白活性'>1.3.2.1 盐胁迫与Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性
• +/H⁺逆向转运蛋白活性'>1.3.2.2 其他胁迫与Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性
• +/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性'>1.3.2.3 转Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白的分子生物学研究'>1.3.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的分子生物学研究
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆'>1.3.3.1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆
• +/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸分析'>1.3.3.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的氨基酸分析
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的表达调控'>1.3.3.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的表达调控
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 本研究的技术路线
• +/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）的克隆及其序列分析'>第二章 NaCl胁迫下拟南芥Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）的克隆及其序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料及试剂
• 2.1.1.1 植物材料及处理
• 2.1.1.2 菌株和载体
• 2.1.1.3 酶和试剂
• 2.1.2 AtNHX1基因cDNA的克隆
• 2.1.2.1 逆转录合成cDNA第一链
• 2.1.2.2 PCR扩增
• 2.1.2.3 AtNHX1基因cDNA与T-载体连接
• 2.1.3 大肠杆菌感受态细胞制备及转化
• 2.1.3.1 感受态细胞的制备
• 2.1.3.2 连接产物转化感受态细胞
• 2.1.3.3 LB培养基
• 2.1.4 重组质粒鉴定
• 2.1.4.1 蓝白斑筛选
• 2.1.4.2 重组质粒鉴定
• 2.1.5 序列分析及同源性比较
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 拟南芥AtNHX1基因的分离
• 2.2.2 AtNHX1基因与pGEM（?）-T Easy Vector连接后的重组子鉴定
• 2.2.3 AtNHX1基因的cDNA序列
• 2.2.4 几个物种NHX1基因cDNA序列的同源性比较
• 2.3 讨论
• 第三章 用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞在不同逆境环境下检测拟南芥rd29A基因启动子的活性
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 rd29A启动子和GFP基因
• 3.1.3 rd29A启动子驱动GFP基因植物表达载体的构建
• 3.1.4 洋葱表皮细胞培养
• 3.1.5 基因枪转化
• 3.1.6 GFP绿色荧光观察
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 rd29A启动子驱动的GFP基因植物表达载体的构建
• 3.2.2 不同培养基中rd29A启动子活性的检测
• 3.2.3 不同培养温度下rd29A启动子活性的检测
• 3.3 讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）植物表达载体的构建'>第四章 pBI121载体的改造及拟南芥Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）植物表达载体的构建
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株和载体
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.1.3 pBI121载体的改造
• 4.1.3.1 pBI121 NOS终止子区段（SacI-EcoRI,265bp,以下简称N区段）的PCR扩增
• 4.1.3.2 pBI121N区段与T-载体连接
• 4.1.3.3 重组质粒的鉴定及测序
• 4.1.3.4 T-载体上的N区段替换pBI121载体上GUS基因后的NOS-ter区段
• 4.1.4 pBI121改造载体（pBI121-GZ）终止子的功能鉴定
• 4.1.4.1 pBI121-GZ与绿色荧光蛋白基因连接
• 4.1.4.2 洋葱表皮细胞培养
• 4.1.4.3 基因枪转化及显微观察
• 4.1.5 不同启动子驱动AtNHX1基因植物表达载体的构建
• 4.1.5.1 质粒DNA的提取
• 4.1.5.2 CaMV35启动子驱动AtNHX1基因表达载体的构建
• 4.1.5.3 rd29A启动子驱动AtNHX1基因表达载体构建
• 4.1.5.4 表达载体转化根癌农杆菌
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 pBI121载体的改造
• 4.2.1.1 pBI121N区段的分离
• 4.2.1.2 N区段与T-载体连接及重组子鉴定
• 4.2.1.3 T-载体上N区段的序列分析
• 4.2.1.4 pBI121-GZ载体的构建
• 4.2.2 pBI121-GZ载体终止子功能的鉴定
• 4.2.2.1 pBI121-GZ载体与GFP基因连接
• 4.2.2.2 pBI121-GZ+GFP载体在洋葱表皮细胞中瞬时表达
• 4.2.3 不同启动子驱动AtNHX1基因植物表达载体的构建
• 4.2.3.1 CaMV35启动子驱动AtNHX1基因植物表达载体的构建 #64.
• 4.2.3.2 rd29A启动子驱动AtNHX1基因植物表达载体的构建
• 35和pBINH₂₉工程菌的获得'>4.2.3.3 pBINH₃₅和pBINH₂₉工程菌的获得
• 4.3 讨论
• 第五章 AtNHX1与GFP融合基因表达载体的构建及其融合蛋白的细胞定位和对盐逆境的瞬时响应
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌株和载体
• 5.1.2 酶和试剂
• 5.1.3 AtNHX1和GFP融合基因植物表达载体的构建
• 5.1.3.1 AtNHX1基因敲除终止密码片段的获得
• 5.1.3.2 敲除终止子的AtNHX1基因片段连接T-载体及测序
• 5.1.3.3 重组质粒的获得
• 5.1.4 洋葱表皮细胞的培养及基因枪转化
• 5.1.4.1 洋葱表皮细胞的培养
• 5.1.4.2 基因枪转化
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 AtNHX1基因终止密码子敲除片段（AtNHX1-NZ）的获得
• 5.2.2 AtNHX1-NZ片段与T-载体连接及重组子的鉴定
• 5.2.3 AtNHX1和GFP融合基因植物表达载体的构建
• 5.2.4 pBIAtNHX1+GFP融合基因蛋白的表达定位
• 5.2.5 AtNHX1+GFP融合基因蛋白对盐逆境的瞬时响应
• 5.3 讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）烟草的获得及其耐盐性表达'>第六章 转拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）烟草的获得及其耐盐性表达
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料及试剂
• 6.1.1.1 植物材料及培养
• 6.1.1.2 菌株和载体
• 6.1.1.3 酶和试剂
• 6.1.1.4 培养基
• 6.1.2 烟草遗传转化和植株再生
• 6.1.2.1 农杆菌的活化
• 6.1.2.2 侵染和暗培养
• 6.1.2.3 转化植株的抗性筛选
• 6.1.2.4 转化植株的盐筛选
• 6.1.3 转基因植株的PCR和PCR-Southern杂交检测
• 6.1.3.1 转基因植株和对照植株的总DNA提取
• 6.1.3.2 转基因植株的PCR检测
• 6.1.3.3 DNA探针标记及标记效率检测
• 6.1.3.4 转基因植株的PCR-Southern杂交检测
• 6.1.4 转基因植株的Southern杂交检测
• 6.1.5 转基因植株的Northern杂交检测
• 6.1.5.1 转基因植株和对照植株的总RNA提取
• 6.1.5.2 RNA探针标记及标记效率检测
• 6.1.5.3 转基因植株的Northern杂交检测
• 6.1.6 转基因植株的耐盐性表现
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 转基因烟草植株的再生
• 6.2.2 转基因烟草植株的PCR和PCR-Southern杂交鉴定
• 6.2.3 转基因烟草植株的Southern杂交鉴定
• 6.2.4 转基因烟草植株的Northern杂交鉴定
• 6.2.5 转基因烟草植株的耐盐性表现
• 6.3 讨论
• 第七章 转拟南芥AtNHX1基因马铃薯的获得及其耐盐性表现
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料及试剂
• 7.1.1.1 植物材料及培养
• 7.1.1.2 菌株和载体
• 7.1.1.3 酶和试剂
• 7.1.1.4 培养基
• 7.1.2 马铃薯遗传转化和植株再生
• 7.1.2.1 农杆菌的活化
• 7.1.2.2 侵染和共培养
• 7.1.2.3 转化植株的抗性筛选
• 7.1.3 转基因植株的PCR和PCR-Southern杂交检测
• 7.1.4 转基因植株的Southern杂交检测
• 7.1.5 转基因植株的Northern杂交检测
• 7.1.6 转基因植株的耐盐性表现
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 转基因马铃薯植株的再生
• 7.2.2 转基因马铃薯植株的PCR和PCR-Southern杂交鉴定
• 7.2.3 转基因马铃薯植株的Southern杂交鉴定
• 7.2.4 转基因烟草植株的Northern杂交鉴定
• 7.2.5 转基因马铃薯植株的耐盐性表现
• 7.3 讨论
• 第八章 讨论
• 8.1 Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐基因工程
• 8.2 拟南芥AtNHX1基因的克隆及其在细胞中的定位和功能鉴定
• 8.3 逆境诱导型启动子的功能鉴定和应用
• 8.4 马铃薯转化外植体的选择及转基因耐盐马铃薯的获得
• 8.5 存在的问题及展望
• 第九章 结论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）'>9.1 克隆到拟南芥Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX1）
• 9.2 检测到rd29A基因启动子具逆境诱导活性
• 9.3 构建了不同启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体
• 9.4 进行了AtNHX1基因的亚细胞定位和瞬时及稳定性抗盐能力检测
• 9.5 转AtNHX1基因马铃薯的获得
• 参考文献
• 附录Ⅰ AtNHX1基因在GenBank登记信息
• 附录Ⅱ 博士在读期间发表的论文
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介