平邑甜茶IPT3基因的克隆及其对氮信号响应特性

论文摘要

在已研究不同形态氮养分对果树叶片生长影响的基础上,为探讨果树叶片生长对根际硝态氮产生较快反应的机理,以水培平邑甜茶幼苗为试材,克隆根系细胞分裂素合成酶（异戊烯基转移酶）编码基因（MhIPT3）,同时采用实时荧光定量PCR研究MhIPT3表达量的变化,采用酶联免疫测定植株中Z+ZR与iP+iPA、IAA、ABA含量的改变,并测定分析了不同供氮形态对植株生长的影响,主要结果如下:1.根据已知苹果异戊烯基转移酶基因的EST序列,设计特异引物利用RT-PCR结合RACE技术获得了异戊烯基转移酶基因,命名为MhIPT3。GenBank注册号为DQ792508。序列分析表明,MhIPT3 cDNA全长1 314 bp,含有963 bp的完整开放阅读框,编码分子量为37.3 KD的321个氨基酸;结构分析发现,MhIPT3蛋白上含有ATP/ADP结合位点;同源性分析发现,MhIPT3蛋白与AtIPTl,AtIPT3,AtIPT4,AtIPT5,AtIPT6,AtIPT7和AtIPT8蛋白同源性分别为34.22%,53.27%,35.34%,55.29%,35.11%,47.43%和38.14%,而与AtIPT2和AtIPT9氨基酸同源性仅为25.1%和25.52%;聚类分析表明,MhIPT3蛋白与LjIPT3（Lotus japonicus）、AtIPT3（Arabidopsis thaliana）和BrIPT3 （Brassica rapa L.）蛋白的同源性最高。以平邑甜茶的DNA为模板进行MhIPT3编码区的克隆,结果发现所克隆的序列与以cDNA为模板所克隆的编码区序列完全相同,说明MhIPT3编码区内没有内含子。构建了pBI121-MhIPT3正反义表达载体,并对烟草和‘皇家嘎拉’苹果进行农杆菌侵染的遗传转化。将MhIPT3编码区正向克隆到原核表达载体pET30a-c（+）,并通过原核表达获得了MhIPT3蛋白,为进一步研究异戊烯基转移酶的功能提供了条件。2.荧光定量PCR分析MhIPT3的表达发现,MhIPT3基因在平邑甜茶的根、茎、叶中均有表达且在叶中的表达量最高。对N饥饿的平邑甜茶施用NO3- 0.5 h后MhIPT3的表达量开始增加,2 h后达到最大,但NH4+处理对MhIPT3的表达没有影响;根中iP+iPA和Z+ZR与MhIPT3表达量呈现相似的变化趋势。处理24 h,NO3-处理与NH4+处理IAA含量差异不显著,ABA含量NO3-处理高于NH4+处理;到第72 h与168 h,IAA含量差异仍然不显著,ABA含量NO3-处理低于NH4+处理;处理24 h,NO3-处理的叶面积略高于NH4+处理,但差异不显著,第72 h测定结果已存在显著差异;且NO3-处理的植株生长量和株高均高于NH4+处理。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 氮信号对植物物质代谢的调控
• 1.2 氮信号对植物生长发育的调控
• 1.3 植物中推测的两个氮信号感应系统
• 1.3.1 PII 介导的N 感应
• 1.3.2 细胞分裂素和His-Asp 磷酸根中继
• 1.4 细胞分裂素的合成
• 1.5 IPT 在细胞分裂素合成中的重要作用
• 1.5.1 AMP 途径
• 1.5.2 ATP/ADP 途径
• 1.5.3 旁路的途径（alternative pathway）
• 1.6 其它植物上编码异戊烯基转移酶基因IPT 的鉴定
• 1.6.1 拟南芥IPT 基因的鉴定
• 1.6.2 其它植物上IPT 基因的鉴定
• 1.7 氮信号对细胞分裂素生物合成的调控
• 1.8 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料与处理
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料总 RNA 的提取
• 2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成（用于3′RACE）
• 2.2.3 反转录cDNA 第一链的合成（用于5′RACE）
• 2.2.4 cDNA 全长基因序列的获得
• 2.2.4.1 3′端基因片段的克隆
• 2.2.4.2 5′RACE 获得5′端基因序列
• 2.2.5 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.6 凝胶电泳中 DNA 片段的回收
• 2.2.7 碱法小量质粒 DNA 的提取
• 2.2.8 DNA 序列测定
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.9.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.9.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.10 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.10.1 感受态细胞的制备
• 2.2.10.2 冻融法农杆菌转化
• 2.2.11 基因组 DNA 提取（CTAB 法）
• 2.2.12 原核表达平邑甜茶异戊烯基转移酶MhIPT3 蛋白
• 2.2.12.1 原核表达载体的构建
• 2.2.12.2 大肠杆菌BL21 原核表达的诱导
• 2.2.12.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.13 MhIPT3 正反义表达载体的构建
• 2.2.14 实时荧光定量 PCR
• 2.2.15 ‘皇家嘎拉’苹果的转化
• 2.2.15.1 组织培养所用培养基
• 2.2.15.2 转化步骤
• 2.2.16 农杆菌介导的烟草的转化
• 2.2.17 转基因植株的检测
• 2.2.18 叶面积的测定
• 2.2.19 激素的测定
• 2.2.20 本研究使用的软件
• 3 结果与分析
• 3.1 异戊烯基转移酶基因（MhIPT3）的分离
• 3.1.1 MhIPT3 3′端基因片段的分离
• 3.1.2 MhIPT3 5′片段的分离
• 3.1.3 MhIPT3 全长cDNA 的分离
• 3.2 异戊烯基转移酶基因（MhIPT3）的序列分析
• 3.3 MhIPT3 在大肠杆菌中的表达
• 3.3.1 原核表达载体的构建
• 3.3.2 重组蛋白表达与SDS-PAGE 分析
• 3.4 转基因烟草表达载体pBI121-MhIPT3 的构建及转基因烟草的鉴定
• 3.5 ‘皇家嘎拉’苹果特异表达载体pBI121-MhIPT3 的构建
• 3.6 基因的表达特性分析
• 3.6.1 MhIPT3 在不同组织中的表达
• 3.6.2 不同形态氮素对MhIPT3 表达的影响
• 3.7 不同形态氮素对细胞分裂素含量的影响
• 3.7.1 不同形态氮素对Z+ZR 含量的影响
• 3.7.2 不同形态氮素对iP+iPA 含量的影响
• 3.8 不同形态氮素对叶片中IAA 和ABA 含量的影响
• 3.9 不同形态氮素对平邑甜茶叶面积及生长的影响
• 4 讨论
• 4.1 MhIPT3基因编码平邑甜茶异戊烯基转移酶
• 4.2 硝态氮促进平邑甜茶幼苗生长与MhIPT3表达、细胞分裂素含量的关系
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间形成的论文