奶牛隐孢子虫感染及微小隐孢子虫单抗的制备

论文摘要

标准微小隐孢子虫卵囊接种经地塞米松免疫抑制的昆明系15g雌性小白鼠,于感染后6天开始利用蔗糖不连续梯度离心法纯化卵囊,提取标准微小隐孢子虫卵囊和标准安氏隐孢子虫卵囊基因组DNA,参照NCBI上下载的18S rRNA的基因序列设计两对扩增引物,进行巢式PCR,对二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,得到508bp和514bp的两条电泳条带,回收PCR产物,ECOT14Ⅰ酶进行酶切后进行琼脂糖凝胶电泳和克隆测序,成功地建立了巢式PCR-RFLP检测隐孢子虫模型,并成功地鉴定微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫虫种。应用蔗糖不连续梯度离心法对采集自上海地区7个大型奶牛养殖场和个体养殖户养殖场奶牛粪便共691份进行了隐孢子虫卵囊的纯化,并利用基因组试剂盒提取隐孢子虫的基因组DNA,然后利用已建立好的巢式PCR-RFLP法进行检测,查出阳性样品奶牛场6个,占85.71%,在128头奶牛的粪便中检测出了隐孢子虫卵囊,阳性率为18.52%（128/691）,说明上海地区确实有隐孢子虫感染。其中经鉴定128份阳性样品中有43份粪便中含微小隐孢子虫,微小隐孢子虫感染率为6.22%（43/691）;85份粪便中含安氏隐孢子虫,安氏隐孢子虫感染率为12.3%（85/691）;犊牛隐孢子虫感染率为26.03%（82/315）,育成牛隐孢子虫感染率为15.38%（40/260）,产奶牛隐孢子虫感染率为4.79%（7/146）。犊牛隐孢子虫感染率较育成牛、产奶牛高。奶牛场隐孢子虫感染率分别为39.58%、0、26.74%、3.80%、19.44%、12.71%、14.63%。样品微小隐孢子与NCBI公布的微小隐孢子虫同源性高达99.2%,与安氏隐孢子虫同源性仅为85.2%-85.8%;发现样品安氏隐孢子虫二次PCR扩增产物序列与NCBI公布安氏隐孢子虫同源性为97.6%-98.4%,与NCBI公布微小隐孢子虫同源性高仅为85.4%。利用经实验室鉴定的上海奶牛微小隐孢子虫卵囊接种于经地塞米松免疫抑制的昆明系15g雌性小白鼠,于感染后6天开始利用蔗糖不连续梯度离心法纯化卵囊,800rpm,离心5min,反复6次提纯后,通过液氮-37℃水浴反复冻融6次和超声波处理,取全卵囊抗原免疫BALB/c小鼠4次,以PEG1450为融合剂,取阳性的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,先用HAT选择培养基培养,再换HT培养基继续培养,最后选取常规培养基培养。经间接ELISA方法筛选阳性克隆孔,有限稀释法进行3次克隆,获得2株分泌抗微小隐孢子虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D5和4E12。2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:3200和1:1600,腹水效价分别为1:102400和51200。采用免疫荧光法对2株单抗腹水进行初步鉴定,发现2株单抗均为抗卵囊壁单抗,无抗子孢子单抗。对2株单抗腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量为54kDa,轻链分子量为24kDa。经Western-Blotting分析,2株杂交瘤细胞分泌的单抗所识别的条带分别约为94 kDa和85 kDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验一 巢式PCR-RFLP检测隐孢子虫模型的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 实验二 隐孢子虫PCR扩增产物克隆测序
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 实验三 上海地区奶牛隐孢子虫感染情况调查
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验四 微小隐孢子虫单克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介