枯草芽孢杆菌渗透压调控启动子的鉴定与功能分析

论文摘要

在本论文研究中,从枯草杆菌基因组中筛选并鉴定了一个受渗透压调控的启动子片段,并以其为表达元件,构建了高效表达系统,具体如下：1.渗透压调控的启动子的鉴定和培养特性的研究从枯草杆菌启动子库中,纯化出克隆子pSI23423,该克隆子在LBON和高渗透压培养基中,展现出不同的β-Gal表达水平,本研究测定了其在大肠杆菌和枯草杆菌中的β-Gal表达量的差异。无论是在大肠杆菌还是枯草杆菌中,在添加了2.5%NaCl的LBON培养基中,pSI23423介导的β-Gal表达量都要比在不添加NaCl的LBON培养基中的β-Gal表达量高。携带pSI23423的大肠杆菌在添加了2.5%NaCl的LBON培养基中培养36h时,β-Gal表达量达到最大值2525.36mill U,这是该菌株在不添加NaCl的LBON培养基中的β-Gal表达量的4.12倍。这个结果显示了pSI23423所含的启动子样片段是受渗透压调控的。在枯草杆菌中的β-Gal表达量相对于大肠杆菌中的表达量较低,但携带pSI23423的枯草杆菌在添加了2.5%NaCl的LBON培养基中的p-Gal表达量,是该菌株在不添加NaCl的LBON培养基中的p-Gal表达量的4.05倍。同样显示了在不同渗透压调控下的表达量的显著差异。2.启动子片段的亚克隆与鉴定为了进一步鉴定pSI23423中的启动子,检测了bgaB基因上游插入的片段,序列分析结果显示,该片段长度为898-bp。利用softberry软件进行启动子预测分析,发现此片段中有两个疑似启动子-10区和-35区。随后进行了下一步的亚克隆工作,分别用两对引物,将这两个片段P23S和P24S扩增并克隆入检测载体pShuttlel,从而得到克隆子pSI23和pSI24。pSI23和pSI24转化宿主菌,在摇瓶培养后分别进行酶活性测定,但实验结果显示pSI24无β-Gal表达活性,而pSI23却有着和pSI23423相同的表达活性趋势,在添加了2.5%NaCL的LBON培养基中,携带pSI23的大肠杆菌和枯草杆菌,β-Gal活性分别达到了3122.44和294.25mill U/mL,转录分析显示该片段有转录本,这证明该启动子为具有渗透压调控型的启动子。3.P23S启动子活性功能检测为了进一步检测启动子的活性,P23S后融合了一个人工RBS位点,从而得到了载体pOMH。将bgaB的编码基因作为报告基因克隆入pOMH,并通过SDS-PAGE进一步检测了其表达量。此外,将大肠杆菌的bioB基因,vgb基因均克隆入pOMH,分别转化宿主菌诱导表达,并在不同渗透压的培养基中进行摇瓶实验,并进行SDS-PAGE蛋白电泳检测,来进一步验证其启动子活性。结果显示5%NaCL添加的情况下,蛋白带明显比在不添加NaCL的培养基中要清晰,由此证明,P23S确实为渗透压调控型启动子。本研究以P23S为表达元件构建了表达系统,该表达系统具有受渗透压调控、高表达水平的特性,具有开发为新型表达系统的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 选题依据、目的及意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌表达系统概述
• 1.2.2 枯草芽孢杆菌载体
• 1.2.3 表达系统重要元件-启动子
• 1.2.4 枯草杆菌启动子探针系统的特点及应用
• 1.3 枯草杆菌表达的现状及发展方向
• 第二章 启动子的鉴定和培养特性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果和分析
• 2.3 小结
• 第三章 启动子片段的亚克隆及序列分析
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 酶切反应
• 3.1.2 DNA电泳
• 3.1.3 启动子片段的亚克隆
• 3.1.4 序列分析
• 3.1.5 转录分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 序列分析
• 3.2.2 启动子活性检测及鉴定
• 3.3 小结
• 第四章 表达载体的构建及检测
• 4.1 实验方法
• 4.1.1 表达载体的构建及基因克隆
• 4.1.2 蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2 结果与分析
• 4.3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 启动子的克隆与纯化
• 5.1.2 序列分析
• 5.1.3 表达验证
• 5.2 创新点
• 5.3 讨论
• 5.4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介