石蒜悬浮细胞系的建立及其生物碱合成途径调控的研究

论文摘要

石蒜（LycorisradiataHerb.）是石蒜科（Amaryllidaceae）的一种多年生草本植物。石蒜鳞茎中含有石蒜碱、加兰他敏和力克拉敏等十几种生物碱。其中加兰他敏是一种可逆的胆碱酯酶抑制剂，可以用于阿尔兹海默病，重症肌无力，肠麻痹和骨髓灰质炎后遗症等的治疗。石蒜碱有抗炎和抗SARS病毒功能。石蒜用于提取加兰他敏具有广阔的应用前景。但是由于石蒜在自然条件繁殖率低，长期滥用野生石蒜等状况，导致石蒜野生资源日益枯竭。石蒜快速繁殖的研究较多，但是其繁殖系数也比较低，依靠快速繁殖技术成本较高。本文对石蒜组织培养和石蒜生物碱成分等研究进展进行了总结，探索出了一种利用愈伤组织悬浮培养的方法获取石蒜生物碱的方法。石蒜愈伤组织诱导及其悬浮培养的研究都未曾见报道，本文首次对石蒜愈伤组织的诱导及其悬浮培养进行了研究。并获得以下结果：1.石蒜愈伤组织的诱导。以石蒜鳞茎为外植体材料，探究了不同鳞茎部位、不同激素组合和一个生长周期的不同时间段对石蒜愈伤组织诱导的影响。研究结果表明，石蒜不同鳞茎部位对石蒜愈伤组织的诱导影响较大，石蒜鳞茎片都能诱导出愈伤组织，其中以内层鳞茎片诱导率最高，愈伤组织质量较好。将石蒜内层鳞茎接种到不同激素组合的培养基上都能诱导出愈伤组织，其中MS+1mg·L-12,4-D+1mg·L-16-BA对石蒜愈伤组织的诱导较好，诱导率可达61.13%，愈伤组织质量较好。在石蒜一个生长周期中不同时间段的鳞茎对石蒜愈伤组织的影响较大，9月份和10月份石蒜鳞茎诱导率较高，愈伤组织质量好，3月份诱导率低，愈伤组织较小，容易分化成不定根。2.石蒜愈伤组织继代培养。石蒜愈伤组织继代培养中容易分化出不定根，通过改变培养基中激素能较好的控制愈伤组织的分化，MS+2,4-D0.5mg·L-1+KT0.5mg·L-1是石蒜愈伤组织继代培养较好的培养基激素组合，愈伤组织增殖较快，不容易分化。在暗培养条件下，石蒜愈伤组织的生长周期为2427天，光照条件下石蒜愈伤组织的生长周期有所减短，生长周期为1821天。石蒜愈伤组织的生长符合“S”型生长曲线，大致可分为迟缓期、对数期和稳定期。3.光照对石蒜愈伤组织生物碱的影响。与暗条件下相比，光照能增加愈伤组织中石蒜碱、加兰他敏和力克拉敏的含量。在一个生长周期中，随着愈伤组织的生长，愈伤组织的生物碱含量下降，当达到对数期的后期，生物碱的含量开始增加，到一个生长周期的后期，愈伤组织的生物碱含量和生长周期开始的愈伤组织的生物碱含量大致相等。4.石蒜再生体系的建立。愈伤组织接种到MS+6-BA2mg·L-1+2,4-D1mg·L-1的培养基上能较好的诱导出小鳞茎，小鳞茎个数多。将小鳞茎接种到MS+NAA3mg·L-1的培养基能诱导出不定根，诱导率可达100%。利用愈伤组织建立了石蒜再生体系，提高了石蒜繁殖系数，减短了生产周期，为提供优质脱毒石蒜组织培养苗提供了理论基础。组培小植株经过炼苗等过程即成为较好的植株，移栽到花盆培养植株生长良好。5.石蒜悬浮细胞系的建立。以石蒜愈伤组织为材料，探究了接种量、激素组合、肌醇和条件培养等因素对石蒜愈伤组织悬浮细胞系建立的影响。接种量15﹪、MS+2,4-D0.5mg·L-1+KT0.1mg·L-1、肌醇300mg·L-1的液体培养条件建立的石蒜悬浮细胞系质量较好，细胞分散性好，活力较高，增长较快。添加对数期的培养液能明显缩短石蒜悬浮细胞系的周期。石蒜悬浮细胞系的生长周期约为7天，生长符合“S”型生长曲线，大致可分为迟缓期、对数期和稳定期。HPLC检测结果显示，石蒜悬浮细胞系的生物碱含量较高，其中加兰他敏的含量可达野外鳞茎的4.18倍。6.前导物对石蒜悬浮细胞系生物碱的影响。石蒜生物碱在体内合成有共同的前体，苯丙氨酸和酪氨酸。实验研究表明，添加苯丙氨酸对石蒜悬浮细胞系的生物碱含量影响不明显，添加酪氨酸和酪胺均能提高石蒜悬浮细胞系的生物碱含量，且影响较大。同时添加苯丙氨酸和酪氨酸对石蒜悬浮细胞系有一定的影响，但是和单独添加酪氨酸差异不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 植物悬浮细胞培养
• 1.2 石蒜组织培养的研究进展
• 1.3 石蒜生物碱的研究进展
• 1.3.1 生物碱
• 1.3.2 石蒜生物碱
• 1.3.3 石蒜主要生物碱及其药用作用
• 1.4 石蒜生物碱合成途径的研究进展
• 1.4.1 生物碱合成途径的研究进展
• 1.4.2 石蒜生物碱合成途径研究进展
• 1.5 前体物对细胞天然产物合成影响的研究进展
• 2 引言
• 2.1 研究目的与研究意义
• 2.2 实验技术路
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 石蒜愈伤组织的诱导及其继代培养
• 3.2.2 石蒜再生体系的建立
• 3.2.3 石蒜悬浮细胞系的培养
• 3.2.4 前体物对石蒜悬浮细胞系的影响
• 4 结果与分析
• 4.1 石蒜愈伤组织诱导及其继代培养
• 4.1.1 石蒜鳞茎不同部位愈伤组织的诱导
• 4.1.2 不同激素组合对石蒜愈伤组织诱导的影响
• 4.1.3 石蒜不同生长时期对愈伤组织的诱导的影响
• 4.1.4 愈伤组织的继代培养
• 4.1.5 不同条件下石蒜愈伤组织的生长周期
• 4.1.6 生长周期中生物碱含量变化
• 4.2 石蒜再生体系的建立
• 4.2.1 不同激素对石蒜愈伤组织诱导小鳞茎的影响
• 4.2.2 不同激素组合对石蒜小鳞茎生根的影响
• 4.2.3 炼苗和移栽
• 4.2.4 石蒜愈伤组织诱导苗与双鳞片诱导苗的比较
• 4.3 石蒜悬浮培养的研究
• 4.3.1 激素对石蒜悬浮细胞生长的影响
• 4.3.2 接种量对石蒜悬浮细胞的影响
• 4.3.3 肌醇对石蒜悬浮细胞的影响
• 4.3.4 条件培养对石蒜悬浮细胞系生长的影响
• 4.3.5 不同材料中生物碱含量的比较
• 4.3.6 石蒜悬浮细胞系再生
• 4.4 前体物对石蒜悬浮细胞系的影响
• 4.4.1 苯丙氨酸对石蒜悬浮细胞系的影响
• 4.4.2 酪氨酸对石蒜悬浮细胞系的影响
• 4.4.3 酪胺对石蒜悬浮细胞系的影响
• 4.4.4 苯丙氨酸和酪氨酸对石蒜悬浮细胞系生长的影响
• 5 讨论
• 5.1 石蒜愈伤组织的诱导
• 5.2 石蒜悬浮细胞培养
• 5.3 前体物对石蒜悬浮细胞系生物碱合成的影响
• 6 结论
• 主要参考文献
• 致谢
• 作者简介