大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响

论文摘要

色氨酸作为必需的氨基酸之一,对于人和动物的生长发育及其新陈代谢都有着重要的意义。广泛应用于医药、食品和饲料添加领域,国内国际市场对色氨酸的需求量也在不断增加。而传统的化学合成法和酶法转化等方法的工艺成本又居高不下,这些原因的存在导致我国至今尚未实现色氨酸生产的工业化。近年来,微生物发酵法生产色氨酸因原料来源十分广泛易得、适宜大规模投产而成为研究热点,因此利用基因工程技术重新设计大肠杆菌代谢系统,构建色氨酸工程菌是本实验研究内容。目的:改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并与之前构建的pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒共同转化入E.coliMG1655ΔRT-R菌株,构建高产色氨酸菌株;并进行实验室发酵的初步实验,分别对培养基、装量、糖浓度变化和pH变化进行摸索比较,选取最优的培养基和装量,并得到针对此工程菌科学的补充碳、氮源的时间频率。方法:根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物进行PCR扩增,将PCR扩增所得PLlacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLlacO1-ppsA-T1片段连接,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒共转化至E.coli MG1655ΔRT-R,获得的重组菌株命名为E.coliMG1655ΔRT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]（工程菌）。对工程菌进行发酵瓶发酵实验。首先根据工程菌在不同培养基中的生长状况,确定了适合工程菌发酵的培养基,然后采用正交实验设计方法,研究了发酵瓶装量,糖浓度以及诱导剂浓度三个试验因素对工程菌生长以及色氨酸产量的影响。以pZE12-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒转化至E.coliMG1655ΔRT-R得到的重组菌株E.coli MG1655ΔRT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作为对照菌株,加入0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,3 hr后收集部分菌体行PpsA、TktA酶活性测定,其余发酵液继续培养4 -5 hr后,监测调整培养基中葡萄糖浓度和pH值保持不变,48 hr后检测色氨酸产量。结果:PCR扩增所得片段均与预期DNA表达片段大小一致;pZA31-ppsA-tktA重组质粒测序显示,克隆的tktA和ppsA基因序列与报告序列完全相同。工程菌PpsA和TktA酶活性（U）与对照菌株比较,分别提高了3和3.5倍（分别为0.25±0.04 vs. 0.08±0.02,P < 0.05;0.21±0.03 vs. 0.06±0.02,P < 0.05）;确定了适合工程菌发酵的培养基,工程菌实验室发酵瓶发酵的最优条件为:发酵瓶装量为100ml、葡萄糖浓度为1%、诱导剂浓度为0.5mM。色氨酸产量（g/L）与对照菌株比较,提高了1.3倍（1.10±0.05 vs. 0.80±0.05,P<0.05）。结论:成功克隆中心代谢途径上两个关键酶基因ppsA和tktA,与对照菌株比较,重组菌酶活分别提高了3和3.5倍。改造了大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,使碳源流向中心代谢途径,为构建高产色氨酸基因工程菌,进一步提高色氨酸产量打下基础。实验室发酵瓶发酵的实验摸索了最适培养基和优化了培养条件,工程菌E.coliMG1655ΔRT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]色氨酸产量达到1.3g/L。为下一步利用发酵罐发酵工程菌打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 L-色氨酸的理化性质
• 2 L-色氨酸工业化生产意义
• 3 L-色氨酸的生产方法
• 4 近年来国内的关于ppsA 和tktA 基因的研究情况
• 5 本文的主要研究内容
• 实验1 大肠杆菌色氨酸生物合成中心代谢途径关键酶基因ppsA 和tktA 的克隆和串联表达
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 3 质粒构建与测量
• 结果
• 实验2 色氨酸工程菌的实验室发酵研究和产量测量
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 讨论
• 1 代谢途径及相关酶作用机制
• 2 色氨酸生物合成的策略与优化
• 3 本研究创新之处
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录1：缩略语索引
• 附录2：文献综述
• 附录3：发表文章
• 附录4：发表文章
• 附录5：发表文章