经典Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘退变中的作用及机制研究

论文摘要

一β-catenin在人退变椎间盘髓核组织中的表达及意义目的检测β连环蛋白（β-catenin）在人退变椎间盘髓核和正常髓核组织中表达差异，初步探讨经典Wnt／β-catenin信号通路与椎间盘退变的关系。方法收集2007年5月至2008年3月于我院手术的腰椎间盘突出症患者髓核组织标本28例（男17例，女11例）作为试验组，平均年龄45岁（26～63岁）；收集同期因腰段脊柱创伤手术治疗的患者髓核组织标本12例（男9例，女3例）作为对照组，平均年龄35岁（18～55岁）。采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白印迹法（western-blot）分别检测退变组和创伤组椎间盘髓核组织β-catenin mRNA与蛋白的表达，比较其差异并进行统计学分析。结果β-catenin mRNA与蛋白表达在退变组中均明显高于创伤组，荧光定量RT-PCR比值约为2.85：1；蛋白印迹各组平均光密度比值分别为0.76±0.04，0.13±0.02，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。结论β-catenin在人退变椎间盘髓核组织中表达增高，提示Wnt／β-catenin信号通路可能在椎间盘退变过程中发挥了作用。二TNF-α注射构建兔椎间盘退变动物模型中β-catenin蛋白的表达及意义目的通过外源性TNF-α注射构建兔椎间盘退变动物模型，探讨该模型中β-catenin蛋白的表达及意义，以明确炎性细胞因子在促进腰椎间盘退变过程中Wnt／β-catenin信号通路的作用。方法选取12只健康成年日本白兔，雌雄随机，体重2.5～3.0Kg。手术暴露L2～53个间隙共36个椎间盘。随机分为4组，分别注入生理盐水，TNF-α5ng，TNF-α10ng，TNF-α20ng，于术后第8周统一处死，取椎间盘髓核组织作HE-番红0染色病理切片进行形态学观察：各组分别随机选取4个椎间盘髓核组织标本，采用蛋白印迹法（western-blot）测定β-catenin蛋白含量并比较各组间差异。结果HE-番红0染色病理切片显示，在5ng、10ng、20ng组椎间盘组织中髓核细胞数量减少，正常网状结构破坏，细胞形态发生改变，出现肥大空泡样软骨细胞，组织基质蛋白聚糖含量明显降低，番红0淡染，表明兔椎间盘退变动物模型构建成功，退变程度与TNF-α浓度相关。生理盐水对照组椎间盘形态基本正常，无退变发生。蛋白印迹结果显示β-catenin蛋白含量在注射TNF-α组明显增加，各组光密度比值分别为：0.142±0.036、0.351±0.041、0.472±0.052和0.710±0.063，组间差异有显著统计学意义（P＜0.05）且与TNF-α浓度相关。结论通过外源性TNF-α盘内注射能够成功构建兔椎间盘退变动物模型，且退变程度与TNF-α呈浓度依赖性；在退变模型髓核组织中β-catenin蛋白含量增高且与TNF-α浓度相关，提示炎症细胞因子触发了Wnt／β-catenin信号通路，在椎间盘退变过程中可能发挥了重要作用。三绿色荧光蛋白标记的重组DKK-1腺病毒表达载体的构建目的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent prorein，GFP）标记的DKK1腺病毒表达载体，对表达产物进行鉴定，分离、纯化并大量扩增方法构建含配对序列、酶切位点和DKK-1基因序列的PCR引物，使用PCR技术从DKK1质粒中提取DKK1基因序列，与pDC315-eGFP真核表达载体分别进行双酶切并纯化酶切产物，在感受态大肠杆菌细胞反应体系中构建真核表达载体，提取阳性克隆进行PCR产物鉴定，同AdMax腺病毒包装系统共转染HEK293细胞重组并包装出腺病毒载体，培养HEK293细胞进行病毒扩增，按Adeno-XTM Virus Purification Kit（BD Biosciences，Clontech）步骤纯化重组腺病毒。使用腺病毒转染正常HEK293细胞，24小时后观察GFP荧光表达情况。结果PCR证实重组腺病毒包含DKK-1基因，转染HEK293细胞后荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光稳定表达，蛋白检测发现可表达GFP。结论成功构建绿色荧光蛋白标记的重组DKK-1腺病毒表达载体，能感染HEK293细胞并表达目的基因，通过GFP标记可连续而直接地观察细胞中的基因表达。四DKK1腺病毒阻断Wnt信号通路对体外培养兔髓核细胞基质的保护作用目的探讨Wnt通路在髓核细胞退变中的生物学机制及DKK1腺病毒阻断Wnt信号通路对体外培养兔髓核细胞基质的保护作用。方法体外培养免椎间盘髓核细胞，取培养第二代细胞随机分为4组加药，A组：空白对照组，正常培养基培养；B组：加入TNF-α20ng／ml作为退变组；C组：加入MOI为200的Adv-eGFP腺病毒液，TNF-α20ng／ml作为荧光对照组：D组：加入MOI为200的Adv-hDKK1腺病毒液，TNF-α20ng／ml作为实验组。转染换液后继续培养一周，PT-PCR法检测不同组β-catenin、Ⅱ型胶原和MMP-13 mRNA的表达；免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原表达；番红0染色检测蛋白聚糖的表达变化，荧光显微镜镜下观察各组eGFP表达情况。结果倒置相差显微镜发现B组和C组髓核细胞数量减少，正常网状结构破坏，细胞形态不规则，排列紊乱；A组和D细胞形态基本正常，部分细胞互相粘附。PT-POR法检测不同组β-catenin、Ⅱ型胶原和MMP-13 mRNA发现：β-catenin mRNA在A组基本不表达，B组和C组明显表达，D组仅少许表达，与内参比值分别为B组0.677，C组0.632，D组0.121；Ⅱ型胶原mRNA在A组和D组表达明显高于B组和C组，与内参比值分别为A组0.652，B组0.159，C组0.214，D组0.638；MMP-13 mRNA在B组和C组表达明显高于A组和D组，与内参光密度比值分别为A组0.184，B组0.627，C组0.632，D组0.154。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示A和D组呈现阳性，B组和C组为弱阳性，仅有少数细胞染色，Ⅱ型胶原蛋白表达明显降低，番红染色显示蛋白聚糖含量在C和B组较A和D组明显降低，胞外基本无红染，仅少数细胞周围淡染。荧光显微镜观察显示C和D组明显荧光表达，A组和B组为阴性，表明Adv-hDKK-1腺病毒成功转染髓核细胞且表达目的基因。结论退变组和荧光对照组细胞发生退行性改变，β-catenin和MMP mRNA表达明显增高，Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达明显降低，蛋白聚糖含量明显降低。实验组细胞形态正常，β-catenin和MMP-13 mRNA仅少许表达，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达正常。这表明200MOI的Adv-hDKK1能成功转染髓核细胞且表达目的基因，DKK1在TNF诱导的髓核细胞退变过程中阻断了Wnt／β-catenin信号通路的作用，保护基质的正常代谢。

论文目录

• 前言
• 摘要
• ABSTRACT
• 正文
• 第一部分 β-catenin在人退变椎间盘髓核组织中的表达及其意义
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 TNF-α注射构建兔椎间盘退变动物模型中β-catenin蛋白的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 绿色荧光蛋白标记的重组DKK-1腺病毒表达载体的构建
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第四部分 DKK-1腺病毒阻断Wnt信号通路对体外培养兔髓核细胞基质的保护作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 附录
• 1 综述Wnt信号通路在软骨形成和分化中的调节作用
• 2 缩略词表
• 3 攻读博士期间发表的论文
• 致谢