三种木腐菌木材降解相关酶以及相关基因TRAP标记的变异

论文摘要

本研究以黑龙江省东北林业大学帽儿山实验林场的3种典型木材腐朽菌为实验材料,包括桦剥管菌一种褐腐菌,木蹄层孔菌和彩绒革盖菌两种白腐菌,以其木质素降解相关酶类为主要研究对象,比较3种木材腐朽菌的LiP、MnP、Lac在不同培养条件下的生理特性；并且采用TRAP分子标记的手段,筛选UP、MnP、Lac、CBHⅡ、CDH编码基因的引物,分析这些编码基因的多态性,证明TRAP分子标记可以应用于木腐菌的遗传分析。常温条件下,彩绒革盖菌表达3种木质素相关酶的能力明显高于桦剥管菌和木蹄层孔菌。不同木腐菌的木质素降解相关酶的表达受各种因素的影响情况各不相同。HCLN培养基对3种木腐菌LiP的表达都有促进作用,LCHN培养基对3种木腐菌MnP的表达都有所促进,HCLN培养基能够在培养早期促进3种木腐菌Lac的表达,而HCHN条件能够在木蹄层孔菌生长的后期促进其表达lac。3种木腐菌表达木质素降解相关酶的最适pH不同,桦剥管菌和木蹄层孔菌表达LiP的最适pH为5.0,而彩绒革盖菌表达LiP的最适pH为4.5。偏酸和偏碱条件在一段时间内对3种木腐菌MnP的表达有明显的促进作用。桦剥管菌表达Lac的最适pH是4.5,彩绒革盖菌表达Lac的最适pH为5.5,而木蹄层孔菌在pH为6.5时Lac的表达量最多。适当增加的Mn2+浓度对3种木腐菌LiP的表达有抑制作用。对于木蹄层孔菌和彩绒革盖菌,MnP活性随Mn2+浓度的增加而增加,当Mn2+ >1.25mmol/L时MnP活性随浓度的增加而降低。Mn2+浓度的增加抑制桦剥管菌表达Lac,促进木蹄层孔菌表达Lac,而对彩绒革盖菌Lac的表达未起到明显影响。热激条件抑制3种木腐菌表达LiP和Lac；促进MnP的表达。实验改良了CTAB法提取3种木腐菌的基因组DNA的方法。确定了3种木腐菌TRAP分子标记的反应体系和反应程序。TRAP-PCR反应的反应体系为：总体积20μL,DNA模板2.0μL（约100ng）,固定引物（10μM）2.0μL,随机引物（10μM） 2.0μL, dNTP （20mM） 2.0μL, MgCl2（25mM）2.0μL,1×buffer 2.0μL, Taq酶0.15μL,去离子水7.85μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环；94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。经过对32对引物进行筛选试验,共确定11对引物,包括3对标记MnP编码基因的引物、3对标记Lac编码基因的引物、3对标记CBH编码基因的引物,以及2对标记CDH编码基因的引物。结果显示,3种木腐菌的TRAP-PCR标记共产生193条多态性条带,占总条带的94.61%,两种白腐菌——木蹄层孔菌和彩绒革盖菌的TRAP-PCR标记共产生61条多态性条带,占总条带的70.93%,由此证明针对这4种编码基因来说,木蹄层孔菌和彩绒革盖菌间的多态性较小,遗传差异相对较小。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 木材腐朽
• 1.1.1 木材的主要成分
• 1.1.2 树木腐朽的类型
• 1.1.3 木材的生物分解
• 1.1.4 木材腐朽菌的种类及其对木材的降解
• 1.2 寄生于白桦的木材腐朽菌
• 1.3 白腐菌木质素降解相关酶酶对植物木质素的降解作用
• 1.3.1 白腐菌对植物木质素的降解作用
• 1.3.2 白腐菌的木质素降解相关酶
• 1.3.3 影响白腐菌木质素降解相关酶的生物学特性的因素
• 1.4 白腐菌表达木质素降解相关酶酶的分子基础
• 1.5 TRAP分子标记
• 1.6 研究目的和意义
• 2 理化条件对3种木腐菌木材降解酶产量的影响
• 2.1 试验材料与设计
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验设计
• 2.2 试验设备与试剂
• 2.2.1 试验设备
• 2.2.2 试验试剂
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 培养基的配制
• 2.3.2 粗酶液的制备
• 2.3.3 酶活性的测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 常温下3种木腐菌木质素降解相关酶产量比较
• 2.4.2 不同碳氮源含量条件下3种木腐菌木质素降解相关酶产量比较
• 2.4.3 不同pH条件下3种木腐菌木质素降解相关酶产量比较
• 2.4.4 不同Mn2+浓度条件下3种木腐菌木质素降解相关酶产量比较
• 2.4.5 热激条件下3种木腐菌木质素降解相关酶产量比较
• 2.5 本章小结
• 3 3种木腐菌木材降解相关酶基因的TRAP标记遗传变异
• 3.1 试验材料
• 3.2 仪器设备与试剂
• 3.2.1 仪器设备
• 3.2.2 试验主要试剂
• 3.2.3 常用试剂的配制
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 3种木材腐朽菌的培养
• 3.3.2 3种木材腐朽菌总DNA的提取
• 3.3.3 引物设计
• 3.3.4 PCR扩增基因片段
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 DNA提取以及浓度测定
• 3.4.2 TRAP反应体系优化
• 3.4.3 TRAP引物筛选
• 3.4.4 TRAP标记结果及分析
• 3.5 本章小结
• 4 结论与讨论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 木腐菌木质素降解相关酶的生理特性
• 4.1.2 影响DNA纯度及浓度的因素
• 4.1.3 TRAP-PCR引物设计
• 4.1.4 TRAP-PCR引物筛选
• 4.2 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢