大鼠束缚—浸水应激不同时间段不同脑区c-Fos表达的比较研究

论文摘要

大鼠束缚-浸水应激（restraint water-immersion stress, RWIS）,作为一种心理和躯体的复合应激模型,能在几小时内产生迷走神经介导的胃运动机能亢进、胃酸分泌增多和急性胃粘膜损伤等现象。此模型已被广泛用来研究应激性胃粘膜损伤的发生机制及其临床治疗药物的筛选等。众多研究表明束缚-浸水应激状态下胃机能紊乱主要是由于脑中神经元的活动异常导致的,而且是通过迷走副交感传出纤维介导的。支配胃的迷走副交感神经纤维主要来自延髓的迷走神经背核,部分来自疑核。此外,延髓孤束核接受来自胃的部分传入信息。延髓最后区是呕吐反射的化学感受触发区,也接受胃的迷走感觉纤维传入。迷走神经背核、孤束核和最后区位置邻近,神经元的相互联系复杂,功能上关系密切,构成迷走复合体。迷走复合体和疑核是调控胃机能的初级中枢。然而电刺激/化学刺激（L-谷氨酸）迷走复合体和疑核均抑制麻醉状态大鼠的胃运动。因此,RWIS状态下,调控胃机能的初级中枢——迷走复合体和疑核神经元是否被兴奋及其活动的时-空模式成为研究的重点和需要解决的首要问题。边缘前脑是调控内脏机能的高位脑中枢,关于大鼠RWIS诱导边缘前脑神经元活动的研究仅局限于中间前额叶皮层（mPFC）和下丘脑室旁核（PVN）,且未系统研究RWIS过程中边缘前脑不同核团中神经元的活动模式。传统观念认为应激反应的中枢效应主要发生在下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴,而众多研究表明RWIS主要诱导副交感神经系统的活动加强。RWIS状态下,整个HPA轴的活动是否加强需要进行探讨。因此,本文拟用即刻早期基因c-fos表达产物c-Fos蛋白作为神经元活动的标志,研究束缚-浸水应激不同时间段诱导的大鼠不同脑区内神经元的时空活动模式,从而探讨束缚-浸水应激致胃机能紊乱的中枢神经机制,为临床探讨从中枢方面防治应激性胃粘膜损伤、改善胃肠动力的新对策提供重要依据。根据束缚-浸水应激时间将雄性Wistar大鼠随机分为5组,分别为应激0 min （即对照组）和应激30、60、120和180 min。此外,为探讨c-Fos表达的内在动力学特征,额外设立一组,大鼠应激30 min再恢复30 min（Group 30-30）,分别与应激30 min和应激60 min的大鼠进行比较。应激完毕后,过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物,测量体温,取胃,甲醛固定统计胃粘膜损伤指数。取胃后,快速心脏灌流固定脑组织及垂体和肾上腺,并进行后固定、脱水处理,然后进行冰冻切片。漂浮切片进行c-Fos蛋白免疫组化显色。c-Fos表达的强弱以单位面积（0.01 mm2）内Fos免疫反应阳性神经元（Fos-IR neurons）的个数与累积光密度来表示。此外,由于不同核团c-Fos表达的基础水平不同,本研究还采用“对照组的倍数”（ multiples of controls）作为这些核团的c-Fos表达的相对强度,即每只大鼠c-Fos表达的量除以对照组c-Fos表达的平均值,统计得“对照组的倍数”。大鼠束缚-浸水应激不同时间段显著影响迷走复合体和疑核中c-Fos蛋白的表达。迷走复合体和疑核都是在应激60 min时c-Fos表达最强,以后随应激时间延长,表达逐渐减弱。值得注意的是,束缚-浸水应激过程中,迷走神经背核的c-Fos表达最强,其次是疑核、孤束核和最后区。迷走神经背核尾段c-Fos表达的高峰出现在应激120 min时,迟于迷走神经背核吻段和中段（60 min）,且尾段c-Fos的高峰表达显著强于同一时间段吻段和中段的c-Fos表达。孤束核中段和尾段的c-Fos表达始终显著强于吻段。这些结果表明,调控胃机能的初级中枢——迷走复合体（尤其是迷走神经背核）和疑核神经元的过度活动可能在束缚-浸水应激致胃机能紊乱中起重要的调控作用,且迷走神经背核和孤束核不同区域的调控作用有所差异。大鼠束缚-浸水应激不同时间段显著影响边缘前脑不同区域c-Fos蛋白的表达。中线皮层区c-Fos表达在应激60 min时达到高峰,随后逐渐降低。隔区和杏仁核的c-Fos表达倾向于在应激120 min时达到高峰。下丘脑大部分核团尤其是视上核（SON）和PVN中c-Fos表达在应激30 min时显著增强,然后维持在相对高的水平。然而,非常值得探究的发现是,束缚-浸水应激过程中,下丘脑SON的c-Fos表达总是最强,其次是下丘脑PVN、皮质后杏仁核（PCoA）、中央杏仁核（CeA）和mPFC。此外,胃粘膜损伤随着束缚-浸水应激时间的延长逐渐加重,而大鼠体温在应激60 min后降低到最低水平。上述核团神经元活动的增强可能与调控机体对RWIS的反应和RWIS诱导的体温降低及胃机能紊乱有关。大鼠束缚-浸水应激诱导HPA轴c-Fos蛋白的表达情况比较复杂,3个器官的表达并不平行。与对照组相比,应激组大鼠HPA轴中的PVN和腺垂体（特别是中间部）有显著多的c-Fos阳性细胞,但每一部位的c-Fos表达在4个不同时间段均无显著差异。HPA轴中的肾上腺皮质束状带在对照组和应激组中均未观察到c-Fos蛋白的表达。束缚-浸水应激诱导PVN和腺垂体（尤其是中间部） c-Fos蛋白的显著表达,提示PVN和腺垂体,尤其是中间部,参与机体对束缚-浸水应激的响应,且上述部位中c-Fos蛋白可能参与调控应激过程中促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的合成。此外,束缚-浸水应激包含着束缚和冷水的双重刺激。已知单纯束缚短时间内并不导致胃粘膜损伤,且大鼠应激后再恢复一段时间体温很快恢复正常,胃粘膜损伤不再加重,脑中一些核团的c-Fos表达也显著减少。冷水刺激可能在RWIS致胃粘膜损伤中起关键作用。冷水刺激引起的体温降低是否是诱发应激性胃粘膜损伤的关键因素?因此,本研究还观察了不同水温下单纯浸水应激对大鼠胃粘膜损伤的影响,以进一步分析体温降低与应激性胃粘膜损伤的关系。研究发现相同水温下束缚-浸水应激和单纯浸水应激导致大鼠产生同等程度的胃粘膜损伤,表明“冷水刺激”在束缚-浸水应激导致的胃粘膜损伤中起关键作用,而“束缚刺激”不起关键作用。浸水的水温越低,腹腔温度就越低,胃粘膜损伤也就越严重,说明大鼠束缚-浸水应激模型中冷水刺激引起体温降低是诱发胃机能紊乱和胃粘膜损伤的关键因素。总之,大鼠束缚-浸水应激不同时间段诱导迷走复合体和疑核中c-Fos蛋白不同程度的表达,表达最强的是迷走神经背核和疑核,提示迷走神经背核和疑核神经元的过度活动可能是束缚-浸水应激致胃机能紊乱的初级中枢机制之一。大鼠束缚-浸水应激不同时间段诱导前脑中不同区域c-Fos蛋白不同程度的表达,表达最强的核团始终是下丘脑SON,其次是PVN、PCoA、CeA和mPFC,这些核团中神经元活动的增强可能是束缚-浸水应激致胃机能紊乱的高位中枢机制之一。延髓迷走神经背核和疑核及下丘脑视上核和室旁核中强烈的c-Fos表达为束缚-浸水应激过程中迷走副交感神经系统活动加强致胃粘膜损伤提供了神经解剖学的直接证据。束缚-浸水应激诱导下丘脑室旁核和腺垂体（尤其是中间部） c-Fos蛋白的显著表达,表明HPA轴中室旁核和腺垂体参与束缚-浸水应激反应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 文献综述
• 1 不同应激源诱导的大鼠脑中c-fos 表达的研究进展
• 1.1 应激源的分类
• 1.2 原癌基因c-fos 与c-Fos 蛋白
• 1.3 躯体应激诱导的c-fos 基因表达模式
• 1.4 心理应激诱导的c-fos 基因表达模式
• 1.5 躯体和心理的复合应激诱导的c-fos 基因表达模式
• 2 大鼠应激性胃粘膜损伤中枢机制的研究进展
• 2.1 中枢神经系统不同脑区与应激性胃粘膜损伤的关系
• 2.2 中枢内神经递质和神经调质对应激性胃粘膜损伤的作用
• 实验研究
• 第1章 大鼠束缚-浸水应激（RWIS）不同时间段迷走复合体（DVC）和疑核（NA）c-Fos 蛋白表达的比较研究
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 RWIS 不同时间段大鼠DVC 和NA 中c-Fos 的表达
• 1.2.2 RWIS 不同时间段大鼠DMV 吻、中、尾段c-Fos 表达的比较
• 1.2.3 RWIS 不同时间段大鼠NTS 吻、中、尾段c-Fos 表达的比较
• 1.2.4 RWIS 不同时间段大鼠的胃粘膜损伤程度
• 1.3 讨论
• 第2章 大鼠束缚-浸水应激不同时间段边缘前脑c-Fos 蛋白表达的比较研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 RWIS 不同时间段边缘前脑中c-Fos 的表达
• 2.2.2 RWIS 诱导的前脑不同核团中c-Fos 表达的比较
• 2.2.3 Group30-30 与 Group30、Group60 前脑某些核团c-Fos 表达的比较
• 2.2.4 RWIS 不同时间段引起的体温变化
• 2.2.5 RWIS 不同时间段引起的胃粘膜损伤
• 2.3 讨论
• 第3章 大鼠束缚-浸水应激不同时间段下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴c-Fos 蛋白表达的比较
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 RWIS 不同时间段HPA 轴中c-Fos 蛋白的表达
• 3.2.2 Group 30-30 与Groups 30，60 腺垂体中c-Fos 表达的比较
• 3.3 讨论
• 第4章 大鼠束缚- 浸水应激模型体温降低与应激性胃粘膜损伤的相关性研究
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 不同水温下应激对大鼠行为、胃粘膜损伤和腹腔温度的影响
• 4.2.2 体温降低与应激性胃粘膜损伤的相关性
• 4.3 讨论
• 小结
• 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论著
• 致谢