伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属部分种群的分类及分子鉴定研究

论文摘要

伞滑刃线虫属（Bursaphlenchus）中松材线虫（B.xylophilus）是松树癌症一松树萎蔫病的病原物。由于其危害严重和防治困难受到世界各国的高度重视,很多国家将其列为检疫对象。鉴于该线虫的重要性以及在分离该线虫的过程中,常分离到该线虫所在属的其它线虫,本研究对松材线虫及其所在属的伞滑刃线虫进行了系统的形态学和分子分类与鉴定研究,探索了利用rDNA的PCR-RFLP、duplex-PCR以及制备松材线虫单克隆抗体等方法构建部分伞滑刃线虫的分类诊断系统;同时对伴随松材线虫分离到的两种外滑刃线虫属种群（松外滑刃线虫和华美外滑刃线虫）进行了形态学与分子鉴定。 本研究对17个伞滑刃线虫群体进行形态学系统性比较,初步鉴定出8个松材线虫群体和6个拟松材线虫群体,2个明显区分于两者的伞滑刃线虫属种。应用rDNA中ITS的PCR-RFLP分析对形态学特征极其相似的来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃线虫属6个群体进行了分子鉴别。其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫,而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一群体等4个群体被鉴定为拟松材线虫。本研究中选用的4种限制性内切酶（HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、cfoⅠ）的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫。同时对来自中国浙江病死木和中国香港木质包装箱的两种伞滑刃线虫进行了形态与rDNA-PCR-RFLP的分析,结果显示来自浙江的伞滑刃属线虫为B.rainulfi,而来自香港的则为B.thailandae,两者均为在中国首次报道。此外运用clustalx1.8、Mega 2软件对所获得的上述四种伞滑刃线虫ITS序列以及从GenBank上下载的部分伞滑刃属线虫序列进行比对,并利用UPGMA法构建部分伞滑刃线虫系统树,12种伞滑刃线虫形成3个组群,反映了伞滑刃线虫属内种间的遗传学关系。 根据松材线虫及从GenBank上下载的其他伞滑刃线虫ITS序列,运用DNAstar软件进行比对分析,依据其在ITS1与ITS2上的差异,设计了松材线虫种的特异性引物。经检测,松材线虫种内群体能特异性扩增出长约580bp的片段,而拟松材线虫则为阴性,酶切与序列测定结果显示与ITS区序列相关部分完全吻合。将用于扩增28S RNA基因D2D3区的通用引物与特异性引物一起进行duplex-PCR扩增,结果所有的松材线虫株系均产生两大小分别约为770bp和580bp的片段;而其他线虫类群只能产生770bp左右的单一片段,无松材线虫种特异性片段。Duplex-PCR可对松材线虫进行种特异性检测,与其它的PCR方法相比,该方法具有灵敏、快速、有效等特点。 在对rDNA中ITS比较的基础上,该研究还探讨了28S RNA基因在分类和鉴定中的作用。通过对

论文目录

• 中文摘要
• Summary
• 第一章 伞滑刃线虫属分类学研究
• 1 伞滑刃线虫属分类学地位
• 2 伞滑刃线虫属的形态学特征
• 3 伞滑刃线虫的种类及其分布
• 4 伞滑刃线虫属中具严重危害性的种
• 4.1 椰子红环腐线虫
• 4.2 松材线虫
• 4.2.1 松材线虫的分布与危害
• 4.2.2 松材线虫的寄主范围与传播方式
• 4.2.3 松材线虫的鉴别特征
• 5 伞滑刃线虫的分类与鉴定
• 5.1 蛋白质
• 5.1.1 酶学
• 5.1.2 血清学方法
• 5.2 激素
• 5.3 脂类
• 5.4 核酸
• 5.4.1 DNA探针
• 5.4.2 PCR为基础的分子标记
• 第二章 单克隆抗体及其在植物线虫学中的应用
• 1 单克隆抗体制备技术概述
• 1.1 杂交瘤技术
• 1.1.1 杂交瘤技术的原理
• 1.1.2 杂交瘤技术的基本流程
• 1.2 噬菌体展示技术
• 2 单克隆抗体与多克隆抗体
• 3.1 单克隆抗体在植物病原线虫诊断中的应用
• 3.2 单克隆抗体技术在植物病原线虫与寄主互作中的应用
• 3.3 单克隆抗体在植物病原线虫结构学中的应用
• 4 植物线虫学中常用的免疫检测技术
• 4.1 沉淀法
• 4.1.1 双扩散法
• 4.1.2 免疫电泳法
• 4.2.1 间接 ELISA
• 4.2.2 双抗体夹心ELISA
• 4.3 免疫印迹检测法
• 4.3.1 斑点免疫结合技术
• 4.3.2 Western印迹
• 4.4 免疫胶体金技术
• 4.5 免疫荧光技术
• 第三章 外滑刃属研究进展
• 1 外滑刃线虫属分类学地位
• 2 外滑刃线虫属的形态学特征
• 3 外滑刃线虫的种类及其分布
• 第四章 几种伞滑刃属线虫的形态与rDNA PCR-RFLP鉴定研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试线虫
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 线虫的分离与培养
• 1.2.2 线虫永久玻片的制作
• 1.2.3 形态观察与鉴定
• 1.2.4 环境扫描电镜样品的制备
• 1.2.5 线虫 DNA提取
• 1.2.6 PCR扩增
• 1.2.7 PCR产物的纯化
• 1.2.8 PCR纯化产物酶切
• 1.2.9 DNA克隆
• 2 结果与讨论
• 2.1 松材线虫与拟松材线虫
• 2.1.1 形态测量
• 2.1.2 雌虫尾尖突与交合伞的特征及其在种内和种间的变异
• 2.1.3 ITS区 PCR扩增及其 PCR-RFLP分析
• 2.2 B．rainulfi
• 2.2.1 形态学特征描述与形态测量
• 2.1.2 PCR扩增及克隆 DNA的测序分析
• 2.1.3 PCR-RFLP分析
• 2.3 B． thailandae
• 2.3.1 形态学特征描述与测量
• 2.3.2 PCR扩增及克隆DNA的测序分析
• 2.3.3 ITS-PCR-RFLP分析
• 2.4 伞滑刃线虫的ITS序列比较分析
• 第五章 利用 Dyplex-PCR以及28S RNA基因的PCR-RFLP对伞滑刃线虫的鉴定研究
• 第一节 利用 Duplex-PCR对松材线虫的特异性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫源
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 线虫的分离与培养
• 1.2.2 引物
• 1.2.3 线虫 DNA提取
• 1.2.4 特异性 PCR扩增
• 1.2.5 序列测定与 PCR一RFLP鉴定
• 1.2.6 Duplex PCR扩增
• 2 结果
• 2.1 特异性扩增
• 2.2 PCR-RFLP分析
• 2.3 Duplex PCR分析
• 3. 讨论
• 第二节 28S RNA基因的PCR-RFLP对伞滑刃线虫的鉴定分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫源
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 线虫的分离与培养
• 1.2.2 线虫 DNA提取
• 1.2.3 线虫 PCR扩增
• 1.2.4 PCR产物的纯化
• 1.2.S PCR-RFLP分析
• 1.2.6 DNA克隆
• 1.2.7 DNA序列测定与分析
• 2. 结果
• 2.1 PCR扩增
• 2.2 PCR-RFLP分析
• 2.2.1 多种限制性内切酶对伞滑刃线虫28S RNA基因D2D3区酶切分析
• 2.2.2 Bsh1236I在伞滑刃线虫属和外滑刃线虫属内种鉴别中的作用
• 2.3 DNA序列测定与比对分析
• 2.3.1 序列测定
• 2.3.2 序列比对分析
• 3 讨论
• 第六章 松材线虫单克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫源
• 1.1.2 细胞、动物和试剂
• 1.1.3 免疫原
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛋白含量测定（Bradford法）
• 1.2.2 动物免疫
• 1.2.3 杂交瘤细胞株的建立
• 1.2.4 阳性孔的筛选及克隆
• 1.2.5 杂交瘤细胞株的保存和复苏
• 1.2.6 特异性鉴定—间接 ELISA法
• 1.2.7 腹水抗体制备、效价的测定与亚类鉴定
• 1.2.8 Western印迹检测
• 2 结果
• 2.1 各伞滑刃线虫粗提蛋白
• 2.2 小鼠免疫
• 2.3 细胞的筛选与克隆
• 2.4 单抗腹水的特异性检测、效价测定及 Ig亚类鉴定
• 2.5 Western印迹分析
• 3. 讨论
• 第七章 两种外滑刃线虫属种群的形态学和分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 虫源
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 线虫的分离与培养
• 1.2.2 线虫永久玻片的制作
• 1.2.3 形态观察与鉴定
• 1.2.4 线虫 DNA提取
• 1.2.5 线虫 PCR扩增
• 1.2.6 PCR产物的纯化
• 1.2.7 PCR纯化产物酶切
• 1.2.8 DNA克隆
• 2 结果
• 2.1 形态及其测量
• 2.1.1 形态学特征描述
• 2.1.2 形态测量
• 2.2 PCR扩增及克隆DNA测序
• 2.2.1 松外滑刃线虫
• 2.2.2 华美外滑刃线虫
• 2.3 PCR-RFLP分析
• 2.3.1 ITS-PCR-RFLP分析
• 2.3.2 28S RNA基因PCR-RFLP分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录A:常用试剂与仪器
• 常用试剂
• 常用仪器
• 附录B:常用试剂与缓冲液的配制
• 1 常用试剂配制
• 2 常用缓冲液配制