RGD-FasL的基因构建、表达、纯化及功能分析

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的头号杀手,手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。放疗、化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞,副作用大,因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,肝癌是所有肿瘤中的第二位致死因素,肝癌的治疗方法及效果对肝癌防治致关重要,近年来,随着肝癌的发病机理和治疗研究的进展,人们认识到细胞凋亡机制的异常在肝癌发生和抗肿瘤治疗中起重要作用,研究发现很多抗肿瘤治疗方法是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,因此,寻找能够诱导肝癌细胞凋亡的活性物质,通过激发肝癌细胞的凋亡途径,达到治疗肝癌的目的是肝癌防治的有效方法之一。由于FasL具有抗肿瘤作用和多种免疫调节功能,FasL疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床实验均表明,FasL对某些肿瘤具有明显的抑制作用;但是由于副作用较大,为FasL的临床应用造成困难。患者常因不能耐受其毒副作用而终止用药。为了降低FasL的副作用,临床多采用局部用药、联合用药、温热疗法等。尽可能降低FasL用药量,增强疗效而不损伤正常细胞,然而,欲从根本上解决FasL的疗效问题还需要对FasL进行遗传改造以获得高特异性、低毒性的新一代FasL,有关这方面的工作,目前主要集中在以下两个方面:一是根据FasL结构与功能的关系研究结果,通过遗传操作,获得FasL突变体,降低其毒副作用;二是将FasL与其它蛋白共同构建双功能的融合蛋白,实现肿瘤靶向治疗。肿瘤靶向治疗是利用特异性的载体或导向系统,将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位,而不影响正常细胞、组织或器官的功能,从而提高疗效、减少毒副作用。肿瘤靶向治疗中治疗靶点、靶向载体和效应分子的选择是关键。整合素是一类膜受体家族,由α和β两个亚单位组成。在部分肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞中,常特异性地高表达某些整合素,如αvβ3,而正常细胞不表达或表达量很低。整合素αvβ3在肿瘤新生血管形成、肿瘤生长和转移过程中发挥重要作用,可以作为一类新的肿瘤治疗靶点;RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的短肽,细胞外基质（ECM）和血液中的粘附蛋白是人体中最常见的含RGD序列的蛋白。研究发现,大部分整合素与其配体的结合过程,是通过识别配体中所含的RGD序列来完成的。目前,利用噬菌体表面展示技术,已经筛选出与一类与整合素αvβ3特异性结合的RGD肽,即ACDCRGDCFCG（RGD-4C）,这类RGD肽可以作为肿瘤靶向载体,特异性地引导抗肿瘤药物到达肿瘤部位,杀灭肿瘤细胞。本研究以整合素αvβ3为靶点,RGD肽为靶向载体,FasL蛋白为抗肿瘤效应分子,构建双靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-FasL,并检测其生物学活性,为深入探讨RGD-FasL的体内靶向抑瘤活性及肿瘤治疗应用前景奠定基础。同时丰富了FasL在肿瘤治疗中的应用形式,为肿瘤靶向治疗提供了新思路。我们获得RGD-FasL基因,构建到表达载体pGEX-5X-1,通过酶切、测序鉴定阳性重组载体。含重组质粒pGEX-5X-1/RGD-FasL的E.coli BL21DE（3）经IPTG诱导表达后,通过不同的诱导时间和诱导剂浓度对重组菌进行诱导表达,确定其最适表达条件为IPTG终浓度为0.5mmol/L、30℃诱导12 h。目的蛋白主要存在包涵体裂解液上清中,表达量占菌体总蛋白的30%以上,过GST Resin柱纯化。经SDS-PAGE分析在Mr 62 000附近有一特异条带,符合目的蛋白理论推算值（Mr约62 700）,扫描分析显示其纯度达95%以上,透析和稀释复性制备正确折叠的融合蛋白。通过流式细胞仪检测肝癌分子表面Fas,CD61的表达,通过体外粘附实验证实RGD-FasL具有靶向性,从而为进一步实验提供了有力基础。MTT比色实验证实,RGD-FasL能抑制小鼠肝癌细胞H22和人肝癌H9101细胞生长,对正常小鼠肝细胞生长没有影响;通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）方法分析证实RGD-FasL诱导H22和H9101细胞凋亡能力;体内实验显示RGD-FasL融合蛋白能有效抑制鼠源性肝癌的生长。在H22小鼠模型中,当RGD-FasL剂量为200mg/kg时,RGD-FasL的抑瘤率为62.5%,优于相同剂量的FasL的抑瘤率（51.3%）:免疫组化及HE染色组织学观察发现RGD-FasL能选择性作用于肿瘤组织,诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常组织及肝组织没有毒副作用。本研究表明:融合蛋白RGD-FasL具有诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长的能力。同时RGD-FasL能够特异性结合肿瘤细胞,具有肿瘤靶向性,有利于发挥FasL的抗肿瘤活性。为深入探讨肝癌的基因治疗提供了新的方法与途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、Fas/FasL系统及其诱导的凋亡在肝癌发生的重要地位
• 1 Fas/FasL系统及其诱导的凋亡
• 2 Fas表达水平与肝癌发生
• 3 FasL表达水平与肝癌发生
• 4 FasL蛋白的应用研究
• 二、RGD肽作为肿瘤靶向载体的肿瘤靶向治疗
• 1 RGD肽及整合素家族概述
• 2 RGD肽抑制肿瘤细胞粘附与迁移
• 3 RGD肽对肿瘤细胞凋亡的影响
• 4 RGD腺病毒载体在基因治疗肿瘤中的靶向作用
• 5 RGD肽作为载体在肿瘤治疗中的应用
• 三、研究目的与内容
• 第一章 融合蛋白RGD-FasL的表达及其活性鉴定
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2.方法
• 2.1 引物的合成
• 2.2 基因的构建
• 2.3 重组质粒的构建及其转化
• 2.4 重组子的筛选和鉴定
• 2.5 目的蛋白的表达
• 2.6 目的蛋白的纯化和复性
• 二、结果与分析
• 1 RGD-FasL的基因构建
• 2 重组质粒的酶切鉴定
• 3 目的蛋白的表达与纯化
• 3.1 RGD-FasL在大肠杆菌中的表达
• 3.2 RGD-FasL蛋白浓度的测定
• 三、讨论
• 第二章 RGD-FasL功能分析
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株和实验小鼠
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要溶液及其配制
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞表面Fas、CD61的表达
• 2.3 RGD-FasL的体外黏附实验
• 2.4 MTT比色法检测RGD-FasL体外活性
• 2.5 Annexin V/PI方法对RGD-FasL诱导细胞凋亡率的检测
• 2.6 RGD-FasL融和蛋白的体内抑瘤实验
• 2.7 HE染色实验
• 2.8 免疫组化方法分析肿瘤组织CD61的表达
• 2.9 TUNEL法检测细胞凋亡
• 2.10 统计学处理
• 二、结果与分析
• 1 流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞表面Fas、CD61的表达
• 2 RGD-FasL与Hela细胞的体外黏附实验
• 3 RGD-FasL对肝癌细胞H22和H9101生长增殖的影响
• 4 Annexin V/PI方法对细胞凋亡率的检测
• 5 RGD-FasL体内抑瘤实验
• 6 HE染色检测细胞凋亡
• 7 免疫组化方法检测肿瘤组织中CD61表达
• 8 TUNEL法检测细胞凋亡
• 三、讨论
• 全文总结
• 【参考文献】
• 致谢