论文摘要
第一部分：人脐静脉内皮细胞、人脐血内皮祖细胞分离、培养及鉴定目的：从人脐带和脐血中分离培养脐静脉内皮细胞（HUVEC）、内皮祖细胞（EPC）,建立人脐静脉内皮细胞、脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为普萘洛尔作用内皮细胞的研究提供细胞来源。方法：采集正常人脐带,应用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法进行HUVEC的分离培养,通过细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定HUVEC,应用RT-PCR、Western blot检测内皮细胞特异性抗原表达；采用密度梯度离心法分离人脐带血单核细胞,在EGM-2培养基中培养,通过差速贴壁法去除红细胞和淋巴细胞,采用免疫组化、免疫荧光和单细胞克隆形成等方法鉴定EPC,应用RT-PCR、Western blot检测内皮祖细胞的特异性抗原表达。结果：酶消化法培养的HUVEC4h左右开始贴壁,24h完全贴壁,7d左右长成单层细胞,倒置相差显微镜下观察细胞呈铺路石样；CD31、CD34、Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性,α-SMA染色阴性；显示出摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合荆豆凝集素等EC的特性,RT-PCR、Western blot检测CD31、CD34、vWF抗原表达阳性,而α-SMA表达阴性；管腔形成实验显示,我们培养的HUVEC可在Ⅰ型鼠尾胶原上自发成管。脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中,24h内培养基内悬浮细胞较多,换液后,悬浮细胞逐渐减少,见较多梭形贴壁细胞,7-14d左右梭形细胞逐渐减少,可见少量铺路石样克隆细胞团出现;细胞免疫组化CD31染色率在第一代细胞为97.52±1.49%, CD34染色率为20.9±2.47%,CD45染色率为0.27±0.10%,CD14染色率为0.15±0.08%,CD105染色率为99.26±3.24%、ALDH染色率为43.75±1.52%,KDR染色率为79.09±2.32%,vWF染色率为98.17±0.47%,CD146染色率为96.23±3.40%,CD133染色率为1.27±0.16%,a-SMA表达阴性；显示出摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合荆豆凝集素等EC的特性；RT-PCR、Western blot检测CD31、CD34、CD105、ALDH、KDR、vWF、CD146抗原表达阳性,CD14、CD45、α-SMA表达阴性;单克隆形成实验显示培养的细胞具有强增殖能力,证明该方法培养的细胞为EPC。结论：采用本培养方法可获得良好的脐静脉内皮细胞、脐血内皮祖细胞。第二部分：普洛奈尔对血管生成及血管发生的影响目的：探讨普萘洛尔对脐静脉细胞、内皮祖细胞及小鼠血管内皮瘤细胞的作用。方法：将不同浓度的普萘洛尔作用于脐静脉细胞,内皮祖细胞,小鼠血管内皮瘤细胞24h、48h、72h、MTT法检查普萘洛尔对它们增殖、凋亡的影响；划痕实验,改良Boyer’s小室检测细胞迁移能力；成管实验检测管腔形成能力：RT-PCR、 Western Blot检测VEGF、FGF-2、MMP-2、MMP-9、CXCR4、eNOS、Bax、Bcl-2、 Caspase-3等的表达。结果：萘洛尔作用HUVEC24h可抑制内皮细胞增殖、划痕实验,改良Boyer’s小室实验显示普萘洛尔呈浓度依耐性抑制HUVEC的迁移,成管实验显示普萘洛尔可抑制HUVEC的管腔形成,其机制可能是通过抑制VEGF、MMP-9的表达,作用48h以上可促进HUVEC的凋亡,其机制可能是调控Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。普萘洛尔对内皮祖细胞、小鼠血管内皮瘤细胞系增殖、无明显影响,呈浓度依耐性抑制两种细胞的迁移,并影响管腔形成,其机制可能是抑制VEGF. MMP-、eNOS、CXCR4的表达。结论：普萘洛尔对内皮祖细胞和小鼠血管内皮瘤细胞系的增殖凋亡无影响,可抑制内皮祖细胞和小鼠血管内皮瘤细胞系的迁移和管腔形成,其机制可能是抑制VEGF、MMP-9、eNOS、CXCR4的表达。第三部分：普萘洛尔抑制血管生成及血管发生的分子机制目的：探讨普萘洛尔抑制血管生成及血管发生的分子机制。方法：将普萘洛尔作用于HUVEC、EPC、EOMA24h后,收集蛋白,Western blot检测ERK、p-ERK、Akt、p-Akt等转录因子的表达；将MEK抑制剂PD98059, Akt抑制剂LY294002单独或与普萘洛尔联合作用于HUVEC、EPC、EOMA, Western blot检测VEGF、MMP-9、CXCR4、eNOS的表达。结果：普萘洛尔呈时间和浓度依耐性抑制HUVEC、EPC、EOMA中ERK、Akt信号通路活性,MEK抑制剂PD98059,Akt抑制剂LY294002可抑制EPC、EOMA中VEGF、MMP-9、CXCR4、eNOS的表达,与普萘洛尔联用进一步抑制VEGF、 MMP-9、CXCR4、eNOS的表达,而在HUVEC中仅抑制VEGF、MMP-9的表达。结论：普萘洛尔通过ERK、Akt信号通路抑制VEGF、MMP-9、CXCR4、eNOS的表达,抑制血管生成及血管发生。
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