气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

气肿疽（Clostridium chauvoei）又称黑腿病,是由气肿疽梭菌引起的反刍动物的急性、发热性传染病。该病主要呈散发或地方性流行,广泛分布于自然界。在一定条件下,可引起机体严重的疾病,给畜牧养殖业带来巨大的经济损失。而针对该病的快速检测技术却很少。迅速、准确地诊断疾病是防治该菌感染的关键。因此,本实验利用灭活的标准气肿疽梭菌C54-1为抗原免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法筛选和克隆后,获得了一株能稳定分泌气肿疽梭菌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,并命名为3B7。对制备的1株（3B7）杂交瘤细胞进行间接ELISA法及Western blotting特异性鉴定,用单抗隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定其MAb亚型,用常规方法进行染色体分析和腹水抗体的效价测定。特异性试验结果显示,MAb只与气肿疽梭菌发生反应,与腐败梭菌、产气荚膜梭菌（A、B、C、D、E型）、大肠杆菌0：157、沙门氏菌045-2（D群）、布鲁氏菌M5-90等均没有反应,具有很强特异性。经单抗隆抗体亚类鉴定试剂盒测定,其MAb的亚型为IgA亚型,轻链为k链,抗体效价为1×105。本研究为气肿疽的快速临床诊断、预防及治疗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 气肿疽研究进展
• 1.1 病原体
• 1.2 流行病学
• 1.3 流行病学
• 1.4 诊断
• 1.5 防制措施
• 2 本课题研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌株、实验动物及细胞
• 1.2 细胞培养液血清及其他主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 气肿疽梭菌菌体裂解抗原制备
• 2.2 小鼠的免疫接种
• 2.3 间接EKISA检测方法的建立
• 2.4 细胞融合
• 2.5 杂交瘤细胞株筛选
• 2.6 克隆化培养
• 2.7 细胞冻存
• 2.8 BAL日/。小鼠腹水单克隆抗体腹水的制备
• 2.9 腹水效价测定
• 2.10 稳定性鉴定
• 2.11 杭气肿疽梭菌单克隆抗体亚类的鉴定
• 2.12 杂交瘤细胞染色体的测定
• 2.13 抗气肿疽梭菌单克隆抗体特异性的鉴定
• 结果
• 1. 气肿疽梭菌菌体裂解抗原的制备
• 1.1 气肿疽梭菌的培养
• 1.2 菌体裂解抗原的制备
• 1.3 气肿疽梭菌抗原含量测定
• 2 间接ELISA方法的建立
• 2.1 抗原最适包被浓度及阴阳性血清最适稀释度的确定
• 2.2 抗原的最适包被温度及最适包被时间的确定
• 2.3 血清最适作用时间的确定
• 2.4 酶标二抗最适工作浓度及最适作用时间的确定
• 2.5 PBS稀释液中封闭液浓度的确定
• 2.6 底物最适显色时间的确定
• 2.7 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 3 杂交瘤细胞株的建立
• 4 稳定性鉴定结果
• 5 MAb亚型鉴定及效价测定结果
• 6 杂交瘤细胞的染色体分析
• 7 腹水效价测定
• 8 抗气肿疽梭菌单克隆抗体特异性的鉴定
• 8.1 MAb的ELISA检测
• 8.2 Western blotting鉴定
• 讨论
• 1 抗原
• 2 实验动物选择和动物免疫
• 2.1 实验动物的选择
• 2.2 免疫方法
• 3 间接ELISA检测方法的建立
• 4 细胞融合
• 5 细胞融合后可置于24孔板和96孔板中培养,96孔板优点
• 6 饲养细胞
• 7 胎牛血清
• 8 杂交瘤细胞的克隆
• 9 气肿疽梭菌单克隆抗体的特异性
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录（攻读学位期间发表论文目录）