家兔视网膜水平细胞缝隙连接蛋白Connexin50，57 mRNA鉴定

论文摘要

缝隙连接是细胞间的通讯方式之一。有大量的形态和电生理数据证实了水平细胞之间存在大量的缝隙连接,并在侧向抑制中发挥重要作用。对于水平细胞中缝隙连接蛋白的分子组成情况,仍然不十分清楚。我们根据缝隙连接蛋白亚基connexin 超家族中的氨基酸顺序的保守性和家兔密码子偏爱性,设计简并引物并利用反转录聚合酶链式反应扩增家兔视网膜cDNA,得到兔缝隙连接蛋白50,57（即Cx50,Cx57）的部分核酸序列。根据兔Cx50,Cx57 的核酸序列设计特异性引物,首次采用单细胞多重反转录聚合酶链式反应技术,在急性分离的兔视网膜水平细胞中,检测到兔Cx50,Cx57 的转录产物。说明缝隙连接蛋白50,57 有可能是组成兔视网膜A 类水平细胞的缝隙连接的结构成分。此后,通过5’-RACE 和3’-RACE分别得到兔Cx50 和Cx57 的全长核酸编码序列,并同其他物种的同类蛋白进行了氨基酸保守性比较,兔Cx50 与小鼠Cx50 和人Cx62 的同源性分别是91%和87%;兔Cx57 与小鼠Cx57 和人Cx62 的同源性分别为73%和75%的。将兔Cx50,Cx57 全长序列克隆到爪蟾卵母细胞表达载体中,构建

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩写简表
• 1 引言
• 1.1 视网膜的结构
• 1.2 水平细胞的功能与其表达的缝隙连接蛋白
• 1.3 缝隙连接（电突触）的结构与功能
• 1.4 缝隙连接的研究现状
• 1.5 视网膜水平细胞中的缝隙连接蛋白仍然有待鉴定
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 视网膜和水平细胞分离
• 2.1.2 cDNA 合成及单细胞反转录聚合酶链式反应
• 2.1.3 RACE
• 2.1.4 体外转录及爪蟾卵母细胞微注射
• 2.1.5 核酸片段的克隆及限制性内切酶反应
• 2.1.6 缓冲液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 兔视网膜的分离
• 2.2.2 兔视网膜组织总RNA 的抽提
• 2.2.3 第一链cDNA 的合成
• 2.2.4 PCR
• 2.2.5 PCR 扩增片段的克隆
• 2.2.6 用DAPI 标记水平细胞细胞核
• 2.2.7 兔视网膜水平细胞急性分离
• 2.2.8 单细胞反转录聚合酶链式反应
• 2.2.8.1 DNaseI 消化基因组
• 2.2.8.2 反转录
• 2.2.8.3 PCR 扩增
• 2.2.9 5’-RACE 和3’-RACE
• 2.2.10 体外转录与产物RNA 的纯化
• 2.2.11 爪蟾卵母细胞的微注射,
• 2.2.12 其余限制性内切酶酶切反应,琼脂糖凝胶电泳,质粒抽提,转化等均参见《分子克隆》。质粒小抽,PCR 产物纯化试剂盒方法均参见厂商提供的方法
• 3 结果
• 3.1 兔缝隙连接蛋白50,57 的部分基因的克隆
• 3.2 单细胞RT-PCR 鉴定兔视网膜A 类水平细胞中connexi1150,57 的转录
• 3.3 兔缝隙连接蛋白Cx50,Cx57 的全长基因的克隆
• 3.4 兔缝隙连接蛋白Cx50 和Cx57 在爪蟾卵母细胞中的表达
• 3.4.1 缝隙连接蛋白基因爪蟾卵母细胞表达质粒的构建
• 3.4.2 缝隙连接蛋白-绿色荧光蛋白融合蛋白爪蟾卵母细胞表达质粒的构建
• 3.4.3 体外转录
• 3.4.4 爪蟾卵母细胞微注射
• 4 讨论
• 4.1 克隆兔缝隙连接蛋白50 和57 的部分核酸序列
• 4.2 在形态上鉴定了的急性分离水平细胞上鉴定了Connexi1150 和57 的转录
• 4.2.1 A 类水平细胞急性分离方法的建立
• 4.2.2 单细胞RT-PCR 分别检测了A 类水平细胞中connexi1150 和57 的mRNA..
• 4.2.3 单细胞多重RT-PCR 鉴定了connexi1150 和57 有可能在一个A 类水平细胞中同时转录
• 4.3 兔缝隙连接蛋白50,57 全长基因的克隆
• 4.4 兔缝隙连接蛋白Cx50 在爪蟾卵母细胞中的表达
• 4.4.1 Cx50 的GFP 融合蛋白成功地转运到了膜上
• 5 致谢
• 6 参考文献