马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因的克隆与功能研究

论文题目: 马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因的克隆与功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 宋波涛

导师: 谢从华,柳俊

关键词: 马铃薯,淀粉,还原糖,低温糖化

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 马铃薯是我国乃至世界的第四大粮食作物,用途广泛,其加工产品薯片和薯条是风靡全球的食品。为了抑制常温贮藏产生的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等问题及延长加工周期,常将马铃薯块茎贮藏在低温条件下。但低温导致块茎中还原糖积累,在高温油炸时发生褐化反应,降低了油炸薯片和薯条的品质,甚至对人体健康产生不良影响。因此,控制“低温糖化”已经成为马铃薯采后生理学研究的热点。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是植物淀粉.糖代谢过程中的一个限速酶,催化还原糖向淀粉方向转化。马铃薯AGPase为异源四聚体,由2个小亚基和2个大亚基组成,AGPase大亚基只起调节作用,而活性则由小亚基控制。前人研究表明,马铃薯淀粉合成曲线与AGPase的积累曲线基本一致,抑制AGPase的活性将导致淀粉合成的部分或全部终止,但AGPase活性与马铃薯块茎还原糖含量间的关系还不十分明确,特别是AGPase活性与马铃薯“低温糖化”间的关系还未见报道。因此,进一步阐明AGPase活性与马铃薯块茎淀粉和还原糖含量间的关系,对于马铃薯淀粉-糖代谢调控具有重要的理论和实践意义。 本研究旨在克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(sAGP),分别构建由组成型启动子CaMV 35S和块茎特异启动子CIPP驱动的正、反义sAGP基因载体以及sAGP干涉载体,通过转化马铃薯,研究sAGP的表达与马铃薯块茎淀粉和还原糖含量间的关系,并揭示sAGP在马铃薯块茎抗“低温糖化”方面的功能。主要结果如下: 1.以sAGP的保守位点设计1对引物,用RT-PCR结合RACE的方法,从低温处理的马铃薯品系JH块茎cDNA中,扩增出一条约1.9kb的特异性条带,DNA序列测定表明,目标片段为sAGP,全长1854bp,包含一个1563bp的开放阅读框架,编码521个氨基酸。5′端有63bp的非翻译区,3′端包含219bp的非编码序列,3′端poly(A)尾端上游12bp和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册,登记号为AY186620。将该基因PCR必要的改造后,克隆到酵母表达载体pMETα-B中,构成表达载体pMETαA4,再将其线性化,用电穿孔法导入Pichia methabolicapMAD16。筛选的重组表达酵母经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳可以检测到50kD左右的特异蛋白带。酶活性测定表明,诱导表达重组酵母的AGPase活性明显上升,证明所克隆的sAGP基因是一个完整的功能基因,其表达产物能提高AGPase活性。 2.为了研究sAGP在调控马铃薯块茎淀粉-糖代谢方面的功能,本研究分别构建了组成型启动子CaMV 35S和马铃薯块茎特异启动子CIPP驱动的正、反义sAGP基因转化载体及RNAi干涉载体,通过转化马铃薯主栽品种“鄂马铃薯3号”和“南中552”,获得各类转基因株系140多个。对其中93个株系的酶活性、还原糖等相关指标分析结果表明,增强sAGP基因的表达,AGPase酶活性提高,淀粉含量上升,还原糖含量下降。在CaMV 35S驱动的转正义sAGP基因株系中,共测定了23个株

论文目录:

缩略词表

摘要

Abstract

第一章 综述

1.1 课题的提出

1.2 马铃薯AGPase的研究进展

1.2.1 马铃薯淀粉合成过程中的主要酶类

1.2.2 马铃薯AGPase的分子结构

1.2.3 马铃薯AGPase的酶活性调节方式

1.2.4 马铃薯AGPase配体结合位点

1.2.4.1 底物结合位点

1.2.4.2 激活因子位点

1.2.4.3 抑制因子结合位点

1.2.5 马铃薯AGPase定位与表达调控

1.2.6 AGPase与块茎的淀粉合成

1.2.7 AGPase的应用

1.3 马铃薯基因功能研究的外源表达系统和抑制系统

1.3.1 外源表达系统

1.3.1.1 甲醇酵母外源表达系统的特点

1.3.1.2 Pichia methanolica表达系统

1.3.1.3 外源基因整合到Pichia methanolica基因组中

1.3.1.4 外源蛋白在甲醇酵母中的高效表达策略

1.3.2 反义RNA和RNAi技术

1.3.2.1 反义RNA技术作用原理

1.3.2.2 反义RNA技术在植物基因工程中的应用

1.3.2.3 RNAi技术及作用机制

1.3.2.4 RNAi技术在功能基因研究中的应用

1.4 研究的目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 RNA与DNA的提取

2.1.1 叶片总RNA的提取(用于反转录和Northern分析)

2.1.2 马铃薯块茎总RNA的提取(用于反转录和Northern分析)

2.1.3 DNA的去除

2.1.4 马铃薯叶片DNA小量抽提(用于转基因植株PCR检测)

2.1.5 马铃薯植株DNA的抽提与纯化(用于Southern杂交)

2.2 质粒的抽提及转化

2.2.1 质粒DNA小量制备

2.2.2 质粒DNA大量制备

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.3 农杆菌感受态制备与遗传转化

2.3.1 农杆菌感受态的制备及转化

2.3.2 农杆菌介导的基因转化

2.4 转基因植株的Northern杂交

2.5 转基因植株的Southern杂交

2.5.1 总DNA的预酶切和酶切

2.5.2 电泳转膜

2.5.3 预杂交

2.5.4 探针标记

2.5.5 杂交

2.5.6 洗膜与放射性自显影

2.6 转基因植株酶活性、淀粉和还原糖的提取与测定

2.6.1 AGPase的提取和活性测定

2.6.2 淀粉和还原糖提取与含量测定

第三章 马铃薯sAGP cDNA的克隆及其在甲醇酵母中的表达

3.1 材料和方法

3.1.1 植物材料、菌种和试剂

3.1.2 培养基及缓冲液的配制

3.1.2.1 培养基配制

3.1.2.2 缓冲液配制

3.1.3 RNA的提取

3.1.4 RT-PCR、RACEs与全长sAGP cDNA的克隆

3.1.4.1 第一链逆转录与双链cDNA合成

3.1.4.2 5′和3′RACE

3.1.4.3 重叠延伸扩增全长cDNA

3.1.4.4 PCR产物的克隆与测序

3.1.5 重组表达载体pMETα-A4的构建

3.1.6 酵母感受态细胞制备与电击转化

3.1.7 重组表达载体线性化与电击转化酵母

3.1.8 毕赤甲醇酵母总DNA的抽提与重组酵母的鉴定

3.1.9 重组酵母的诱导表达与SDS-PAGE电泳

3.1.10 诱导重组酵母中AGPase活性测定

3.2 结果与分析

3.2.1 5′RACE、3′RACE及重叠延伸PCR

3.2.2 扩增产物的克隆与验证

3.2.3 sAGP基因cDNA分子特征与序列分析

3.2.4 酵母表达载体构建

3.2.5 重组子的筛选与重组酵母的PCR鉴定

3.2.6 sAGP在甲醇酵母中的表达及SDS-PAGE电泳分析

3.2.7 诱导重组酵母中AGPase活性测定

3.3 讨论

第四章 载体构建与植株再生研究

4.1 材料与方法

4.1.1 植物材料、菌株和质粒

4.1.2 拟南芥转运肽的克隆

4.1.3 载体构建

4.1.3.1 sAGP基因与转运肽At81融合

4.1.3.2 组成型表达载体pBISA和pBIRA构建

4.1.3.3 块茎特异表达载体pBICA和pBICRA构建

4.1.4 转化再生植株起源的细胞学观察

4.2 结果与分析

4.2.1 拟南芥转运肽的克隆

4.2.2 At81测序与序列分析

4.2.3 sAGP基因与转运肽At81融合

4.2.4 组成型表达载体构建

4.2.5 块茎特异表达载体构建

4.2.6 转化再生植株起源的形态变化

4.2.7 转化植株再生起源的细胞学观察

4.3 讨论

第五章 CaMV35S驱动的正、反义sAGP基因表达及对马铃薯茎淀粉和还原糖含量的影响

5.1 材料与方法

5.1.1 植物材料

5.1.2 马铃薯的遗传转化

5.1.3 转基因植株的PCR、Southern和Northern杂交检测

5.1.4 转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量测定

5.2 结果与分析

5.2.1 转基因马铃薯的获得与分子鉴定

5.2.2 转基因马铃薯块茎中sAGP基因表达分析

5.2.3 转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量

5.3 讨论

第六章 sAGP基因在马铃薯块茎中特异表达及其抗“低温糖化”功能研究

6.1 材料与方法

6.1.1 植物材料与菌株

6.1.2 马铃薯的遗传转化

6.1.3 转基因植株的PCR、Southern和Northern杂交检测

6.1.4 转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量测定

6.2 结果与分析

6.2.1 转基因马铃薯的获得与分子鉴定

6.2.2 转基因马铃薯块茎中sAGP基因表达分析

6.2.3 转基因马铃薯块茎AGPase活性、淀粉和还原糖含量变化

6.2.4 正义和反义sAGP基因的表达对块茎抗“低温糖化”能力的影响

6.3 讨论

第七章 马铃薯干涉体系的建立及sAGP基因功能的进一步验证

7.1 材料与方法

7.1.1 植物材料、菌株与载体

7.1.2 sAGP基因RNAi载体构建与遗传转化

7.1.3 转基因植株的PCR和Northern杂交检测

7.1.4 转基因马铃薯植株AGPase活性测定

7.2 结果与分析

7.2.1 干涉载体构建

7.2.2 转基因马铃薯的获得与分子鉴定

7.2.3 转基因马铃薯植株中sAGP基因表达分析

7.2.4 转基因马铃薯植株AGPase活性测定

7.3 讨论

第八章 讨论

8.1 sAGP基因在调节马铃薯块茎淀粉-糖代谢中的作用

8.2 sAGP的可能作用机制

8.3 sAGP的有效利用

8.4 后续研究展望

8.4.1 sAGP基因的定点突变研究

8.4.2 其他代谢调节基因与sAGP的同时利用

8.4.3 专一特异启动子的发现与利用

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

• [1].收获期马铃薯块茎物理特性及损伤机理研究[D]. 冯斌.甘肃农业大学2018
• [2].马铃薯块茎不同花色素苷转化机制研究[D]. 刘芳.山东师范大学2018
• [3].马铃薯块茎损伤评价技术研究及损伤变色性状的遗传分析[D]. 张建华.中国农业科学院2008
• [4].马铃薯块茎SGAs合成的光信号应答基础及关键酶基因克隆和调控设计[D]. 王旺田.甘肃农业大学2012
• [5].营养因素对马铃薯块茎发育生理特性影响的研究[D]. 郑顺林.四川农业大学2008
• [6].氮素形态及其供应时期对马铃薯块茎发育的影响及机理[D]. 苏亚拉其其格.内蒙古农业大学2016
• [7].马铃薯块茎抗低温糖化基因工程研究[D]. 张金文.华南热带农业大学2001
• [8].马铃薯氮素吸收分配特性及高效利用生理机制研究[D]. 焦峰.黑龙江八一农垦大学2012
• [9].MYB和bHLH转录因子对马铃薯块茎花色素苷生物合成的调控机理研究[D]. 刘玉汇.甘肃农业大学2016
• [10].遗传因素和环境条件对马铃薯产量、品质、养分吸收影响的研究[D]. 张胜.内蒙古农业大学2011

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