黄瓜cDNA芯片和ESTs技术平台的建立及其在逆境研究中的应用

论文摘要

环境胁迫是影响植物高产优质的一个重要因子,解析温度、光照和养分等逆境对蔬菜系统发育的影响不仅具有重要学术价值,而且对蔬菜生产具有一定的指导意义。我国园艺设施相对简陋,缺乏设施专用品种,生产上极易受到各种逆境的危害,单产只有发达国家的1/4—1/3。但植物的抗逆性涉及了多基因调控的复杂的代谢网络,近年来发展的基因芯片技术因具有微型化、集约化和标准化的优点,在拟南芥、水稻等模式植物的抗逆研究上显示出极为广阔的应用前景。为了更系统全面地研究蔬菜对生物与非生物胁迫的响应机制,本文以主要设施蔬菜黄瓜（Cucumis sativus L.）为研究对象,通过RT-PCR从黄瓜叶片中克隆黄瓜重要代谢途径中的关键酶基因,建立黄瓜cDNA芯片技术平台;并利用该自主开发的黄瓜cDNA芯片对缺镁、高温、黄瓜花叶病毒（CMV）侵染等逆境胁迫下黄瓜重要功能基因的表达和代谢途径的响应开展了研究;利用实时荧光定量技术（QRT-PCR）验证了黄瓜cDNA芯片的可靠性。另外,通过构建NaCl胁迫下的黄瓜根组织cDNA文库并进行表达序列标签（ESTs）分析,获取了一系列盐胁迫相关基因,为进一步完善黄瓜cDNA芯片奠定基础。主要取得以下结果: 1)、基因芯片技术在研究植物基因功能中发挥着越来越重要的作用,本实验通过Genbank搜索已发布的生物代谢途径中的关键酶基因序列,设计特异性的引物,采用RT-PCR法从黄瓜叶片中扩增这些酶的相应基因片段。在完成432个黄瓜基因片段的克隆分离、测序和生物信息学分析工作的基础上,对克隆PER产物的扩增和纯化方法、基因芯片片基和点样仪组合等进行了比较、分析和优化,并应用优化后的条件成功点制了国内首张黄瓜cDNA芯片。该芯片上含有9个质控cDNA片段和423个cDNA探针,涉及光反应、卡尔文循环、碳水化合物代谢、水-水循环、信号传导、激素代谢、光呼吸、防御、蛋白与氨基酸代谢等多个代谢途径。利用该芯片对黄瓜缺镁胁迫下的基因表达谱进行了初步研究,发现在缺镁胁迫下差异表达的22个基因,其中10个基因的表达受缺镁处理抑制,12个基因的表达受缺镁处理诱导,推测Rubisco大亚基和ATP合成酶CFO B亚基的下调可能是缺镁引起光合速率下降的主要原因之一。该芯片的研制为进一步高通量研究黄瓜功能基因的时空变化提供了有效的技术支撑。 2)、高温是引起农作物减产的常见原因之一。我们应用本实验制备的黄瓜cDNA芯片对黄瓜高温胁迫早期的基因表达谱进行了研究,共获得了77个差异表达显著的基因,其中42

论文目录

• 摘要
• 第一章 前言
• 1 植物抗逆性研究进展
• 1.1 植物抗逆性概述
• 1.2 胁迫介导的代谢调整
• 1.3 胁迫诱导基因的调控与表达
• 2 基因芯片在研究植物抗逆性上的应用
• 2.1 基因芯片技术原理
• 2.2 基因芯片的种类和特点
• 2.3 基因芯片在研究植物抗逆性上的应用
• 3 表达序列标签（EST）在植物抗逆性研究中的应用
• 3.1 EST技术的原理和方法
• 3.2 EST在植物抗逆性研究中的应用
• 4 本项研究工作的目的与意义
• 第二章 黄瓜生物代谢途径中关键酶基因芯片探针的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与实验处理
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA质量检测结果
• 2.2 黄瓜目的基因序列的生物信息学分析
• 2.3 基因片段长度分布
• 3 讨论
• 第三章 黄瓜CDNA芯片的制备
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与实验处理
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 大规模探针质粒PCR扩增效果检测：
• 2.2 大规模探针PCR产物纯化方法的优化：
• 2.3 点样载体的优化选择：
• 2.4 芯片质量检测评估：
• 3.讨论
• 第四章 缺镁胁迫下黄瓜基因差异表达的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与实验处理
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 缺镁对黄瓜光合速率的影响
• 2.2 缺镁对黄瓜叶片基因表达的影响
• 2.3 黄瓜cDNA芯片杂交质量评估：
• 3 讨论
• 第五章 高温胁迫早期黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养及处理
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 黄瓜cDNA芯片杂交结果
• 2.2 差异表达基因的功能分类
• 3 讨论
• 3.1 高温胁迫从转录水平改变了黄瓜碳、氮代谢
• 3.2 高温胁迫引起酶促防御系统相关基因表达发生变化
• 3.3 高温胁迫引起上调表达的基因
• 第六章 侵染CMV胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养及处理
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CMV侵染对黄瓜植株生长的影响
• 2^-产生速率和H₂O₂含量的变化'>2.2 CMV侵染对黄瓜植株O₂^-产生速率和H₂O₂含量的变化
• 2.3 CMV侵染对黄瓜气体交换和叶绿素荧光参数的影响
• 2.4 CMV侵染对黄瓜POD和PAL活性的影响
• 2.5 cDNA芯片杂交数值分析
• 2.6 CMV侵染下差异表达基因的功能分类
• 3 讨论
• 3.1 CMV侵染使黄瓜光合、碳水化合物代谢途径发生了变化
• 3.2 CMV侵染使氮素代谢途径发生了变化
• 3.3 CMV浸染引起酶促防御系统相关基因表达发生变化
• 3.4 CMV浸染引起防卫基因的上调表达
• 第七章 NACL胁迫下的黄瓜根CDNA文库构建及质量分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养及处理
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA和cDNA第二链质量检测
• 2.2 cDNA文库的质量检测
• 3 讨论
• 第八章 黄瓜根表达序列标签（ESTS）的获取及盐胁迫相关基因的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料培养及处理
• 1.2 实验方法
• 2.结果
• 2.1 黄瓜根ESTs基本特征
• 2.2 EST序列分析
• 2.3 高丰度表达EST分析
• 2.4 假定的盐胁迫相关基因
• 3.讨论
• 3.1 盐胁迫处理的黄瓜根ESTs的特征
• 3.2 涉及盐胁迫耐性相关基因的鉴定
• 第九章 大规模质粒测序影响因素研究
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 测序步骤
• 2.结果和分析
• 2.1 质粒DNA序列分析
• 2.2 质粒DNA的质量
• 2.3 测序反应中模板的加样量
• 2.4 电泳条件
• 3.讨论
• 第十章 主要结论及研究展望
• 1 主要结论
• 2 本研究的主要创新点
• 3 研究展望
• 参考文献
• ABSTRACT