Armillariella tabescens（E-20）cDNA文库部分克隆随机测序及阿拉伯糖苷酶全长cDNA的克隆与表达

论文摘要

假密环菌（Armillariella tabescens）为白磨科真菌,寄生于树干基部或根部,引起多种树木腐病,菌体可食用。有报道菌丝体可用于治疗急性胆囊炎,慢性胆囊炎急性发作,急性传染性肝炎,迁延性肝炎,慢性肝炎。其含有的杂多糖组分体外实验证实能抑制小鼠S180肿瘤的生长和增强巨噬细胞的活性,也有报道该菌属的某些种对霉菌毒素（如黄曲霉毒素）有解毒作用。为了深入的研究和开发该菌,本研究利用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的该菌的表达型cDNA文库,为进一步的开发运用做前期准备。 本组应用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的产黄曲霉毒素解毒酶的假密环菌E-20的表达型cDNA文库。从文库中随机挑选150个克隆做5′端测序,得到120条表达序列标签（EST）并将测序结果提交到EMBL数据库。测序结果表明:插入片段长度均在200～800之间,已测通的序列有59条,85条序列3′端有Poly（A）。测序结果经过生物信息学分析,发现有41条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。 利用已获得的序列AJ620046设计基因特异性5端引物,提取E20的总RNA为模板,用5′-RACE技术获得一段401 bp的片段,将此片段与AJ620046拼接后得到长度为1016bp的全长cDNA序列。在全长cDNA序列的基础上,用End to end PCR技术得到了一条完整的开放阅读框的序列AF。运用生物信息学方法分析了AF的核酸、氨基酸序列、蛋白的二级结构和功能预测,超家族分析显示AF属于alpha-L-arabinanase。将PCR扩增获得的AF插入毕赤酵母分泌型载体pHIL-S1中构建重组质粒pHIL-S1-AF,用Sal Ⅰ线性化重组子,通过同源重组整合于毕赤酵母GS115染色体的AOX1区,重组菌株表型为Mut+HIS+,用MM和MD培养基筛选转化子,甲醇诱导表达重组菌,SDS-PAGE测定目的蛋

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究的意义及思路
• 1.2 cDNA文库克隆随机测序的原理
• 1.3 生物信息学的应用
• 1.3.1 表达序列标签（EST）的意义
• 1.3.2 核酸序列、氨基酸序列、蛋白质结构和功能预测的分析
• 1.4 阿拉伯糖苷酶的简介
• 1.4.1 阿拉伯糖苷酶的分类与性质
• 1.4.2 阿拉伯糖苷酶的研究进展
• 1.4.3 阿拉伯糖苷酶的应用
• 1.5 由EST到全长cDNA的基因克隆策略
• 1.6 酵母菌表达系统的简介
• 1.6.1 酵母表达系统的优缺点
• 1.6.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 第二章 实验设备及材料
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种及载体
• 2.2.2 酶类
• 2.2.3 试剂盒
• 2.2.4 常用试剂
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 试剂与母液配制
• 第三章 A.tabescens.（E-20）cDNA文库部分克隆的随机测序
• 3.1 前言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 部分文库铺平板
• 3.2.2 随机挑选150个克隆转换克隆的形式
• 3.2.3 测序
• 3.2.4 测序结果的初步分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 测序结果
• 3.3.2 BLAST同源性分析结果
• 第四章 全长cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达
• 4.1 AF全长cDNA的克隆和信息学分析
• 4.1.1 菌E-20的培养
• 4.1.2 总RNA的提取
• 4.1.3 5’RACE
• 4.1.4 AF的生物信息学分
• 4.2 毕赤酵母系统表达目的蛋白
• 4.2.1 pHIL-S1-AF重组子在酵母中的表达
• 4.2.2 带组胺酸标签的重组子pPIC9-AF在酵母中的表达
• 4.2.3 阿拉伯糖苷酶的酶学性质分析：
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 总RNA提取的结果
• 4.3.2 5’RACE的结果
• 4.3.3 AF的生物信息学分析
• 4.3.4 重组子pHIL-S1-AF在GS115中的表达结果
• 4.3.5 重组子pPIC9-AF在GS115中的表达结果
• 4.3.6 阿拉伯糖苷酶的酶学性质分析结果
• 第五章 讨论
• 5.1 cDNA文库克隆随机测序
• 5.2 阿拉伯糖苷酶全长cDNA的分析
• 5.3 生物信息学分析
• 5.3.1 序列比对分析（Blast）
• 5.3.2 AF的信息学分析
• 5.4 影响目的蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素
• 5.4.1 外源基因在酵母中表达产物的分泌
• 5.4.2 外源蛋白的酶解
• 5.4.3 宿主菌及载体的选择
• 5.4.4 密码子
• 5.4.5 发酵条件的优化
• 5.5 影响目的蛋白活性的因素
• 5.6 阿拉伯糖苷酶的酶学性质分析
• 结论及展望
• 英文缩略词表
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢